MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO BIOLOGÍA GENERAL Y CELULAR
NEIL VASQUEZ ARAQUE, Biol., M.Sc
WILSON GUERRERO CASTRO, I.A
CONTENIDO
NORMAS GENERALES DEL TRABAJO EN EL LABORATORIO DE BIOLOGIA……………………………………………………………………………...3
MICROSCOPIA………………………………………………………………………..7
ALGAS Y PROTOZOARIOS………………………………………………………..26
HONGOS Y BACTERIAS………………………………………………………….. 37
CELULAS VEGETALES Y ANIMALES………………………………………… 47
ESTUDIO DE LA HOJA……………………………………………………………..59
ESTUDIO DE LA FLOR……………………………………………………………..75
MITOSIS I……………………………………………………………………………..85
DISECCION DE VERTEBRADOS……………………………………….................92
CONTEO Y VIABILIDAD CELULAR*……………………………………………98
PURIFICACION DE CELULAS POR GRADIENTES*…………………………104
PERMEABILIDAD DE MEMBRANA CELULARES*………………………….111
FOTOSINTESIS*……………………………………………………………………117
ACCION DE ENZIMAS DE TEJIDO VEGETALES Y ANIMALES*…………126
EXTRACCION DE ADN*…………………………………………………………..132
MITOSIS II…………………………………………………………………………..137
EXTRACCION Y SEPARACION DE PIGMENTOS FOTOSINTETICOS*…..142
INTRODUCCION
Las guías consignadas en este manual procuran conducir al estudiante de primer año universitario de ciencias biológicas en el fascinante mundo de la experimentación biológica. Como es apenas lógico, el trabajo de experimentación supone una actitud protagónica y constructiva por parte del alumno; bajo la orientación del profesor. Consiguiendo así, la confirmación de algunos fenómenos expuestos en las clases teóricas, además de la familiarización del estudiante con el trabajo de laboratorio. En tal sentido, al inicio de cada práctica el profesor ofrece una breve introducción sobre los fundamentos básicos y metodología de la práctica.
En otras palabras se busca que el estudiante se aproxime al método científico; a partir de la observación, la proposición de hipótesis, la experimentación y la formulación de conclusiones, dando inicio a la investigación científica.
Se han incluido distintas guías orientadas a los cursos de biología general y Biología celular. Casi todas, comunes a los programas de la facultad de ciencias y ciencias agropecuarias de la Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín; tal como lo son ingeniería forestal, Zootecnia, Ingeniería agronómica, Ingeniería agrícola e Ingeniería Física, sin embargo; algunas de las prácticas son preferentemente ofrecidas a los alumnos del programa de ingeniería Biológica.
El cuerpo de cada una de las guías consta de los siguientes partes, introducción, con la que se da una idea general del contenido del tema , los objetivos propuestos en la practica, un marco teórico, el procedimiento o actividades a desarrollar, cuestionario de consulta y la bibliografía.
Neil Vásquez Araque
Wilson Guerrero Castro
NORMAS GENERALES DEL TRABAJO EN EL LABORATORIO
DE BIOLOGIA
• Lea cuidadosamente las normas generales del trabajo en el laboratorio de Biología .El desconocimiento o falta de atención por parte suya, no lo eximen de la responsabilidad.
• El éxito de la prácticas depende la lectura de los conceptos básicos de la guías antes de realizarlas.
• Asista puntualmente al laboratorio. Las prácticas están diseñadas para utilizar el tiempo previsto.
• El uso bata de laboratorio durante el desarrollo de la práctica es obligatorio. El contacto con productos químicos, biológicos es inevitable; por ello es aconsejable no utilizar ropa o calzado descubierto.
• El laboratorio de Biología no es un lugar peligroso, sin embargo se debe guardar prudencia y conocimientos básicos por parte del experimentador para evitar riesgos.
• Esta prohibido fumar, beber o comer al interior del laboratorio.
• El uso de elementos de seguridad es imprescindible en algunas practicas (guantes de látex)
• Cada estudiante es responsable por los equipo (s) y área de trabajo asignados. La perdida o daño debe ser informada oportunamente a los encargados de dirigir la practica.
• Los productos utilizados se dispondrán en los recipientes destinados para tal fin.
• Asegurarse del completo enfriamiento de los elementos sometidos a calentamiento en la práctica.
• Mantener el área de trabajo despejada. Las maletas, bolsos deben ser ubicados en los mesones o casilleros.
• Evite verter productos químicos por el desagüe.
• No sobreponer etiquetas, si es necesario retirar las originales.
• Debe evitar acercar los disolventes con temperaturas de ignición bajas a estufas, hornos, placas calefactoras, etc. con superficies muy calientes. No oler ni probar productos químicos.
• Limpiar inmediatamente cualquier vertido que se produzca en la zona de trabajo.
• El material corto punzante se colocará en los contenedores específicos (Guardianes).
• Se utilizarán jeringas y agujas hipodérmicas únicamente en las operaciones específicas extremando las precauciones en el manejo y la eliminación.
• Se utilizarán preferentemente agujas y jeringas de un solo uso, quedando prohibida la reencapsulación de las agujas.
• Se señalizarán los lugares con la advertencia de peligro por agentes biológicos.
• Cada grupo de prácticas se responsabilizará de su zona de trabajo y de su material.
• Antes de utilizar un compuesto hay que fijarse en la etiqueta para asegurarse de que es el que se necesita y de los posibles riesgos de su manipulación.
• No tocar con las manos y menos con la boca los productos químicos o de riesgo biológico.
• Leer cuidadosamente la información impresa en la etiqueta de productos químicos. Los rombos de colores indican el tipo de peligrosidad que estos representan.
• Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como lupas y microscopios, deben manejarse con cuidado evitando los golpes o el forzar sus mecanismos.
• Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc.) deben mantenerse alejados de la llama de los mecheros. Si hay que calentar tubos de ensayo con estos productos, se hará al baño María, nunca directamente a la llama. Si se manejan mecheros de gas se debe tener mucho cuidado de cerrar las llaves de paso al apagar la llama.
• Cuando se manejan productos corrosivos (ácidos, álcalis, etc.) deberá hacerse con cuidado para evitar que salpiquen el cuerpo o los vestidos. Nunca se verterán bruscamente en los tubos de ensayo, sino que se dejarán resbalar suavemente por su pared.
• El traslado del microscopio de un lugar a otro debe hacerse sujetando el mismo de la base y del brazo.
• Las laminillas porta y cubreobjetos deben tomarse por los extremos
• Finalizada cada sesión de la práctica, el estudiante debe dejar limpia y ordenada el área de trabajo.
• Los microscopios son equipos de uso común, por tanto deben quedar debidamente limpios y guardados.
PRACTICA DE MICROSCOPIA
1. INTRODUCCIÓN
La microscopía es una herramienta fundamental de la Biología y sus especialidades (______,2002).Un microscopio simple (de un lente o varios lentes), es un instrumento que amplifica una imagen y permite la observación de mayores detalles de los posibles a simple vista (Davidson et al, 2008). Uno de los instrumentos más importantes para el estudio de las estructuras celulares ha sido el microscopio. Su uso solo fue posible hasta el año 1665, cuando Robert Hooke examino un trozo de corcho, identificando sus paredes celulares (Solomon et al; 2007).
La práctica de microscopia incluye dos partes, en la primera se pretende que el estudiante adquiera destreza con el manejo del microscopio compuesto; las partes, algunos principios ópticos, y recomendaciones generales en el laboratorio. La segunda parte de microscopia consta de los cálculos y determinaciones aproximadas de algunas células vegetales y otras estructuras.
2. OBJETIVOS
• Identificar los sistemas que componen el microscopio compuesto y sus funciones.
• Entender los conceptos básicos de microscopio tales como poder de resolución, apertura numérica, refracción de la luz, poder de aumento y campo visual en relación a las lentes utilizadas.
• Adquirir destreza en el uso y manejo del microscopio compuesto.
• Calcular del diámetro del campo visual para luego realizar mediciones aproximadas de células y otras estructuras.
3. MARCO TEORICO
La palabra microscopio viene del griego mikrós que significa pequeño y Skopein que significa mirar, examinar (Ávila, 2003). El microscopio es un instrumento óptico que sirve para aumentar considerablemente la imagen de los objetos muy diminutos. La microscopía estudia las partes más pequeñas a través del microscopio (Ver figura No 1: microscopio óptico). El conocimiento de las estructuras del ser vivo está basado casi totalmente en el estudio con el microscopio. El microscopio óptico es un instrumento que permite la observación de objetos y detalles de estructuras tan pequeñas que no podrían ser observadas a simple vista. A continuación se dan a conocer los tipos de microscopios, componentes del microscopio óptico y su funcionalidad, aspectos teóricos sobre el funcionamiento del microscopio óptico, manejo y enfoque del microscopio, limpieza y conservación y finalmente normas generales de uso en el laboratorio. Existen actualmente diversos tipos de microscopios ópticos que se diferencian fundamentalmente en la fuente de luz empleada (___________,2008).
A. Tipos de microscopios
a.1 Microscopio compuesto o de campo claro: El microscopio más común se denomina microscopio compuesto o microscopio de campo claro .El microscopio actual recurre a una distribución específica de grupos de lentes para amplificar las imágenes. La fuente luminosa es un filamento de tungsteno cuya luz es dirigida a un solo punto por la lente condensadora. El haz luminoso se localiza por debajo y se enfoca sobre la preparación que debe ser lo bastante fina como para que la luz pueda atravesarla. Al pasar por la muestra, parte de la luz es absorbida y la diferencia de absorción de la luz en diferentes partes del espécimen produce contrastes que revelan detalles de su estructura. Finalmente, la luz pasa a través de las lentes objetivos que se encuentran asentadas sobre una torreta móvil localizada por encima de la preparación directamente hasta el observador (___________,2002).
a.2 Microscopio de contraste de fase. El microscopio de contraste de fase permite observar células y tejidos sin tinción o tratamiento alguno que interfiera con el metabolismo de los microorganismos y por eso resulta especialmente útil para el examen de células vivas(___________,2002;French and Hebert, 1982). La luz que pasa por regiones de mayor índice de refracción experimenta una reflexión y se retarda, quedando desfasada con respecto a las ondas adyacentes. Estas diferencias de refracción no resultan evidentes con el microscopio óptico, pero con el microscopio de contraste de fase las longitudes de onda fuera de fase se anulan con otras mediante el concurso de una serie de anillos del sistema óptico, con lo cual puede verse el objeto con un grado de contraste apropiado (___________,2002).
Figura No 1. Microscopio óptico. Figura No 2. M.E. de Transmisión. Figura No 3.M.E. de barrido. (Imágenes tomadas de www. fai.unne.edu.ar).
a.3 Microscopio de fluorescencia. El microscopio de fluorescencia permite detectar objetos fluorescentes, sean autofluorescentes o que absorban tintes fluorescentes específicos, los cuales irradian rayos visibles cuando reciben luz de onda ultravioleta (French and Hebert, 1982).
a.4 Microscopio confocal .El microscopio confocal consiste en un microscopio compuesto al que se le ha añadido un detector fluorescente y una fuente láser que barre la muestra con un ángulo de incidencia muy pequeño. Ello produce la excitación de la muestra en un plano de espesor muy pequeño por lo que se pueden obtener cortes ópticos muy finos de la muestra (1μm). La luz emitida por los fluorocromos se recoge con un fotomultiplicador y se almacena y procesa digitalmente utilizando un ordenador. Todas las imágenes obtenidas se pueden visualizar individualmente o integrarse informáticamente y permiten obtener imágenes finales en tres dimensiones (_______,2002).
a.5 Microscopio ultravioleta. En el microscopio de luz ultravioleta se analiza la absorción de luz UV por los componentes de la muestra. Tiene un modo de funcionamiento similar a un espectrofotómetro, pero permite registrar los resultados como una fotografía. Por supuesto, no permite la observación directa de la muestra debido a la incapacidad del ojo humano de captar la luz Ultravioleta por lo que requiere de un mecanismo similar al fotográfico para capturar la imagen. Se utiliza para detectar ciertos componentes muy específicos en las muestras, tales como ácidos nucleicos o ciertos aminoácidos.
a.6 Microscopio de luz polarizada. Este microscopio se basa en el diferente comportamiento que presentan ciertos tejidos y estructuras celulares cuando se utiliza la luz polarizada. La luz se desplaza en infinitos planos pero al pasar a través de ciertos prismas polarizadores, se selecciona un determinado plano de polarización. Por otro lado, otros prismas, analizadores, realizan el proceso contrario convirtiendo la luz polarizada en normal. El prisma polarizador se encuentra en la lente condensadora, mientras que el analizador lo está en los oculares (_____,2002). Utilizado para observar sustancias o inclusiones celulares cristalinas (French and Hebert, 1982).
a.7 Microscopios electrónicos (MET1 y MEB 2)
1
Microscopio electrónico de Transmisión: Este microscopio posee varios lentes electromagnéticos cuya función en iluminación y en la formación de la imagen es similar a las del condensador, el objetivo y el ocular del microscopio de luz. El condensador concentra el flujo de electrones sobre el objetivo ;el objetivo forma la primera imagen , que a su vez es aumentada por el lente intermediario ; y por ultimo , la unidad ocular esta representada por uno o dos lentes proyectores que forman una imagen real y aumentada de la imagen intermediaria , sobre una pantalla fluorescente (French and Hebert,1982). Este tipo de microscopio proyecta electrones a través de una fina capa de tejido o material a observar produciendo una imagen en dos dimensiones sobre una pantalla fosforescente (Lanfranconi, ____). Ver figura No2.
2 Microscopio electrónico de barrido.En el microscopio electrónico de barrido se hace incidir un delgado haz de electrones acelerados, con energías desde unos cientos de eV hasta unas decenas de keV (50 KeV), sobre una muestra gruesa, opaca a los electrones. El poder de resolución del microscopio es determinado directamente por el área mínima que la sonda es capaz de escanear. El menor diámetro de la sonda con un número mínimo de electrones. Los microscopios electrónicos de barrido pueden ampliar los objetos 200.000 veces o más. Este tipo de microscopio es muy útil porque, al contrario que los TEM o los microscopios ópticos, produce imágenes tridimensionales realistas de la superficie del objeto (________,2005a).
B. Componentes del microscopio compuesto
Este tipo de microscopio consta de dos partes fundamentales:
b.1 Sistema óptico
Podemos considerar a este sistema como el componente fundamental del microscopio, ya que el aumento y poder resolutivo depende exclusivamente de él. El sistema óptico está compuesto por: Ocular, Objetivo, Condensado, Diafragma, Filtro, Espejo o fuente de luz. Las funciones de cada una de sus partes, es la siguiente:
1. Fuente de luz o foco. Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
2. Filtro. Circulo de vidrio azulado que selecciona las bandas de luz más favorables para los estudios micrográficos, generalmente de longitud de onda de 540.
3. Condensador. Lente que concentra los rayos luminosos hacia la preparación.
4. Diafragma. Situado bajo el condensador, regula la cantidad de luz que incide sobre la preparación.
5. Objetivo. Lente situado cerca de la preparación. Amplia la imagen de esta.
6. Ocular. Lente situado cerca del ojo del observador. Amplia la imagen del objetivo (Helms, 1998).
b.2 Sistema mecánico
1. Soporte. Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: La base o pie y el brazo.
2. Platina .Lugar donde se coloca la preparación.
3. Cabezal. Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular o binocular.
4. Revolver. Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite al girar, cambiar los objetivos.
5. Tornillos de enfoque. Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico que consigue el enfoque correcto (Bernal Rivera, _____, Helms, 1998).
Figura No. 4. Microscopio compuesto. Partes del Sistema óptico y mecánico
(Universidad Nal. De Colombia, Sede Medellín. Escuela de Biociencias, Laboratorio Biología)
C. Aspectos teóricos sobre el funcionamiento del microscopio óptico.
Está formado por dos lentes convergentes: lente objetivo, situado muy cerca del objeto y el lente ocular, al otro extremo del tubo; está situada más cerca del ojo y hace la función de lupa sobre la imagen que produce la lente objetivo. La lente objetivo es muy convergente (f=2 cm. la de la siguiente figura) y el objeto debe colocarse más allá de su punto focal, pero cerca de él (Ver figura No 5).
Figura No 5. Formación de imágenes (Tomada de http://teleformacion.edu.aytolacoruna.es/FISICA/document/fisicaInteractiva/OptGeometrica/Instrumentos/Microscopio/microscopio.htm)
El ocular se coloca de manera que la imagen formada por la lente objetivo (flecha amarilla) caiga sobre el punto focal de ella, F2. En la figura está un poco más cerca de la lente. Cuando una imagen se forma en el foco, F2, la luz emerge del ocular en forma de un haz de rayos paralelos y forma la imagen en el infinito, pero el ojo, sin esfuerzo de acomodación, la concentra en la retina. El ocular logra que veamos la imagen del objetivo con un ángulo aparente mayor que si el objeto estuviera en el punto próximo del ojo. La lente objetivo produce una imagen mayor, real e invertida, y la lente ocular, actuando sobre ella, la hace más grande pero la deja invertida y virtual. La imagen que da el microscopio es mayor, virtual e invertida. La imagen final después de pasar por el ojo se forma en la retina. La distancia entre el punto focal imagen del objetivo y el punto focal objeto del ocular se llama longitud del tubo, L. En los microscopios tiene un valor fijo: 16 cm. (Ver figura No. 5).Algunas características del microscopio con las siguientes:
C.1 Poder de Aumento
Dado que el objetivo da lugar a una imagen real aumentada que es nuevamente aumentada por el ocular, el aumento total del microscopio compuesto será el producto del aumento del objetivo por el del ocular. Si bien es importante conocer el aumento del microscopio con el que se trabaja, no lo es tanto como saber el poder resolutivo del mismo.
El aumento (A) esta dado por la relación:
A= Tamaño de la imagen
Tamaño del objeto
(González y Espinel, 2004)
Ejemplo — Si un Objetivo tiene x20 con un ocular de x10 dará un aumento total de x200, que se suele abreviar escribiendo ø 200 (200 diámetros).
C.2 Poder de resolución
El poder de resolución de un microscopio se define como la distancia mínima entre dos puntos que el sistema óptico es capaz de representar claramente (French and Hebert, 1982¸_______.1968).
La apertura numérica es un factor determinante en la eficiencia de un objetivo y del condensador para dar imágenes con alta resolución. Se puede definir como la capacidad que tiene un objetivo de utilizar más o menos los rayos luminosos que recibe desde la fuente de iluminación (French and Hebert, 1982; _____________. 2005 a). Este factor depende directamente de dos circunstancias que influyen en la cantidad de luz que llega a la lente frontal: el índice de refracción y la apertura geométrica de la lente (Pertusa, _____).
La apertura numérica responde a la fórmula:
AN = n sen α
Donde n es igual al índice de refracción del medio que se encuentra entre el objetivo y la preparación. Normalmente este medio es aire (n=1) o aceite de inmersión (n=1,4). El ángulo α se corresponde a la mitad del ángulo máximo con el que el rayo de luz entra al objetivo desde un punto enfocado en la preparación. Es un valor fijo para cada objetivo y se acerca a 90 cuanto más se acerca la muestra al objetivo alcanzando un valor de α de 90 º donde el seno es igual a 1(French and Hebert, 1982; _____________ . 2005 a). En el aire, el valor de n = 1. El aceite de inmersión tiene un valor n = 1,515. Por esta razón el máximo valor que puede alcanzar la apertura numérica será próximo a 1,5. (Manzanares y Casanovas, ______) .Los fabricantes marcan el número de la apertura numérica en la montura del objetivo junto con el aumento. (Ver figura No. 6). La calidad de un objetivo es tanto mayor cuanto más elevada es su apertura numérica.El poder de resolución, cuando d es la distancia mínima de resolución, se determina utilizando el valor A.N y la longitud de onda (que para estos efectos se puede considerar constante) según la formula:
Figura No 6. Apertura numérica y aumento del objetivo.
(Universidad Nacional de Colombia. Escuela Biociencias, Laboratorio de Biología)
PR =_____ λ ________
2 (A.N)
Donde λ = longitud de onda de la luz. Por lo tanto, a una menor longitud de onda y mayor apertura numérica la resolución será menor, es decir, la distancia a la que se observarán dos objetos cercanos como separados será menor (French and Hebert, (1982); es decir cuanto menor sea la longitud de onda, tanto mayor la resolución.( Solomon et al, 2007).
C3. Campo visual del Microscopio
Es el área circular que se observa al mirar a través del microscopio y varía según las lentes utilizadas. Cuando Usted observe la placa que contiene las letras impresas. Con cuál de los dos objetivos 10X ó 40X, observa mayor área de una de las letras? El campo visual de un microscopio es entonces mayor o menor según se observe con mayor o menor aumento?
D. Manejo y enfoque del microscopio óptico
1. Bajar la platina hasta el tope.
2. Colocar el objetivo de menor aumento (4x) en posición de observación.
3. Colocar la preparación sobre la platina.
4. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación.
5. La platina debe colocarse en la posición más baja, lo más distante del objetivo posible, y se coloca la preparación en la platina.
6. Una vez dispuesta la preparación sobre la platina con la muestra en el centro, utilizando el revólver y sin tocar el objetivo se elige el objetivo de menor tamaño y por tanto de menor aumento.
7. Si se va a trabajar con objetivos en seco (no el de inmersión) y con preparaciones sin teñir el condensador no es necesario, por ello, se debe colocar en la posición más baja, lejos de la platina, para que no haya un exceso de luz sobre la preparación. En caso contrario, se procede a la inversa.
8. A continuación se debe regular la distancia de las lentes oculares ajustándola a los ojos.
9. Seguidamente procede al enfoque. El enfoque de la imagen se efectúa con los tornillos estriados de las cremalleras que mueven a las lentes objetivos hacia arriba y hacia abajo por encima de la preparación. El tornillo de enfoque grueso o macrométrico mueve a las lentes en incrementos mayores que el tornillo de enfoque fino o micrométrico.
10. Una vez enfocado, se gradúa con el diafragma la cantidad de luz requerida, incluso se puede variar ligeramente la altura del condensador si ello mejora la calidad de la imagen.
11. A continuación se desplaza la platina con una mano o mediante los tornillos adosados a la platina en todas las direcciones para recorrer la muestra mientras que con la otra mano se rectifica continuamente la posición del tornillo micrométrico Antes de pasar a objetivos de mayor aumento, conviene seleccionar la zona de la preparación que se quiere observar y, para ello, se debe centrar en el campo de visión que ofrece el microscopio, pues de otra manera, con objetivos de mayor aumento, es muy probable que se pierda el campo elegido.
12. Terminado el examen de la muestra se baja la platina y se quita la preparación. A continuación se desconecta de la fuente eléctrica y se cubre el microscopio con la funda protectora.
4. MATERIALES
Microscopio compuesto óptico, microscopio, portaobjetos, cubreobjetos, papel para lentes, papel absorbente, bloc de papel tamaño carta, lápiz, papel milimetrado, gotero, pedazo de papel periódico impreso, tijeras, Aguja capotera o estilete, cuchilla nueva, corcho, alas de mariposa.
5. PROCEDIMIENTO
5.1 Medición de diámetro (d) del campo visual de un microscopio
Para hacer mediciones al microscopio se utiliza normalmente un aparato llamado micrómetro. Sin embargo, cuando se carece de él, se puede medir en forma aproximada el diámetro del campo visual y utilizar dicho diámetro para calcular posteriormente el tamaño de cualquier organismo o estructura que se observe. Tal medición puede efectuarse con el empleo de papel milimetrado, en la siguiente forma:
Haga un montaje en fresco de un pedacito de papel milimetrado. Enfoque con el objetivo de 10X y, empleando el carro, trate de que una línea de papel quede como diámetro del campo visual tal como se muestra en la siguiente figura:
Figura No 7. Calculo del diámetro del campo visual
(Universidad Nacional de Colombia. Escuela Biociencias, Laboratorio de Biología)
Esquematice lo observado y proceda luego a determinar dicho diámetro, asignando un valor aproximado al segmento X. El valor del diámetro estará dado por la suma de X + Y (generalmente oscila entre 1mm y fracción de mm hasta 2 mm). Anote el valor encontrado (en mm y en µm) ya que es un dato que Usted utilizará posteriormente en algunas mediciones. Tenga en cuenta que este valor puede variar de microscopio a microscopio por lo cual los resultados de sus compañeros puede ser diferentes al suyo.Relación entre poder de aumento y tamaño de diámetro del campo visual de un microscopio.
Tome de nuevo la preparación en fresco con el pedacito de papel milimetrado y enfoque con el objetivo de 40X tratando de que una línea de papel quede como diámetro, tal como lo hizo en el procedimiento anterior. Esquematice lo observado y calcule el diámetro de este nuevo campo visual. Para hacerlo, mueva el carro de manera que pueda determinar aproximadamente cuántos de los diámetros que Usted observa están contenidos en 1mm. Según los cálculos que acaba de hacer, ¿Cuál es el valor del diámetro en mm y en µm?. Es este diámetro la mitad, la tercera parte, la cuarta parte, etc., del diámetro calculado cuando Usted utilizó el objetivo de 10X? El diámetro es directa o inversamente proporcional al poder de aumento del objetivo, manteniendo constante el ocular?.
Como ha podido darse cuenta, la medición del diámetro con objetivo de 40X presentará mayor margen de error que la medición con objetivo 10X. Y mayor aún, si usted midiera, por este método, el diámetro del campo visual con objetivo de 100X. Para obviar lo anterior, se utiliza una fórmula matemática que relaciona entre sí los diámetros y los poderes de aumento.
Para calcular el diámetro del campo visual con mayor aumento, se utiliza la siguiente relación. En donde a1 es el poder de aumento menor, a2 es el poder de aumento mayor, d1 es el diámetro del campo visual con menor aumento y d2 es el diámetro del campo visual con mayor aumento.
Calcule ahora, por medio de la fórmula, el diámetro (en mm y en µm) del campo visual de su microscopio con objetivo de 40X y compárelos con el obtenido al utilizar papel milimetrado.
Calcule el diámetro del campo visual de un microscopio dado con objetivo 100X y ocular de 10X, si el diámetro del campo visual de ese microscopio, con objetivo de 10X y ocular de 4X, es de 2400 µm.
5.2 Observación de letras y números.
Coloque el portaobjetos sobre una superficie plana; con un gotero deje caer una gota de agua en el centro de la placa. Luego coloque sobre la gota letras y números asimétricos (a, d, e, f, g, 3, 5. 7 etc). Coloque el cubreobjetos sobre el portaobjetos formando un ángulo de 45°, y déjelo caer lentamente para evitar la formación de burbujas que podrían dificultar la observación. Observe en 100X y 400X, dibuje lo observado y describa las características de la imagen.
5.3 Observación de pared celular en células de corcho.
La mayoría de las células vegetales tienen una pared rígida por fuera de su membrana plasmática, sus componentes principales son celulosa y hemicelulosa, además de lignina. La dureza de los tejidos vegetales, diferente a la mayoría de los tejidos animales, se debe a la presencia de dicha pared.
Tome un trozo de corcho, y con una cuchilla nueva realice un corte que llegue a ser casi transparente. Colóquela sobre el portaobjeto, ponga el cubreobjetos y observe en 100X y 400X. Dibuje lo observado y calcule el tamaño promedio de una célula de corcho.
5.4 Observación de escamas de mariposa.
Existen células de animales de la clase de los insectos, cuya estructura externa esta conformada por quitina. Esta le proporciona a las células rigidez y a la vez le sirve de soporte.
Tome un pedazo de ala de mariposa, con la aguja de disección haga un pequeño raspado de las escamas, dejándolas caer sobre el portaobjetos, coloque encima el cubreobjetos. Dibuje lo observado en 100X y 400X y calcule el tamaño de una escama de mariposa.
6. CUESTIONARIO DE CONSULTA
A-¿Cuales son los poderes del microscopio? ¿Cómo los comprobó?
B- Calcule el tamaño de un organismo en micrones con base en los siguientes datos: diámetro del campo de visión con el objetivo de 10x es 1.4mm; el organismo ocupa la ¾ partes del diámetro del campo de visión con el objetivo de 40x.
C-Cual es el poder de resolución aproximado para:
• El ojo humano
• El microscopio compuesto
• El microscopio electrónico
D- Con base en la respuesta anterior, ¿con que observaría los siguientes organismos y/o células?
• El diámetro promedio de una bacteria es de 0.5 a 1.0 μm (micrones);
• Un glóbulo rojo humano es de 7.5 μm;
• Un micoplasma (bacteria pequeña) 0.2 μm;
• Un virus relativamente grande como el virus del mosaico del tabaco (TMV) es de 10-300 nm (nanómetros).
• Un óvulo humano es de 150 μm.
E- Si el microorganismo A mide 120 m y el microorganismo B mide 1200 Aº, cual de los dos tiene mayor tamaño?
F- Indique en qué se basa la diferencia que permite una mayor resolución al microscopio electrónico que al óptico.
G- Compare brevemente los elementos del microscopio óptico y del microscopio electrónico indicando el paralelismo de sus funciones.
H-¿Cómo se calcula el aumento total del microscopio?
I- Calcule el tamaño real de una célula cuyo tamaño aparente al microscopio óptico con un objetivo de 40x y un ocular 10x es de 0,75 mm.
J- ¿Cuántos grupos de lentes hay en el microscopio y que nombres reciben?
K- Al desplazar el portaobjetos, ¿en qué sentido se mueve la imagen y por qué?
L- ¿Por qué es interesante centrar lo que nos interesa de la preparación si queremos observarlo a gran aumento?
M-Describa brevemente utilizando un ejemplo, las diferencias existentes entre aumento y resolución. Según su descripción, ¿tiene la imagen de un tejido obtenida con un objetivo 40x y aumentada 100 veces la misma resolución que una imagen obtenida con un objetivo x100 y aumentada 4 veces?
N-La observación de estructuras subcelulares al microscopio óptico es prácticamente imposible a no ser que la estructura sea muy grande. Indique qué técnicas y microscopio utilizaría para observar estructuras como la mitocondria, el aparato de Golgi o el citoesqueleto celular.
7. BIBLIOGRAFIA
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DAVIDSON, M. W. ABRAMOWITZ, M. OLYMPUS AMERICA INC., AND THE FLORIDA STATE UNIVERSITY. 2008. Basic Concepts in Optical Microscopy.
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LANFRANCONI, M. ___________. Historia de la microscopia. Introducción a la Biología. Facultad de Ciencias exactas y Naturales. Universidad Nacional de Mar de Plata. Disponible en: www.ump.edu.ar Consultado 24 de Julio de 2008.
BERNAL, R. M. __________.Practicas de laboratorio, Microscopia. Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Medicina. Depto de Microbiología. Disponible en: www.unal.edu.co. Consultado 24 de Julio de 2008.
PRACTICA DE ALGAS Y PROTOZOOS
1. INTRODUCCIÓN
Las algas son habitantes comunes y normales de aguas poco profundas y se encuentran en todo suministro de agua expuestos la luz del sol (Palmer, 1962). También pueden ocupar otros ambientes como el suelo, las rocas, las cortezas de árboles e incluso la nieve(Peña et al, 2005).Algunas algas son indicadoras de la contaminación con aguas negras domesticas y de la purificación natural de las corrientes, también se las considera útiles como indicadoras del origen de de determinadas aguas; de la contaminación de aguas subterráneas con aguas superficiales, del avance de las alteraciones de las aguas negras en los tanques de oxidación ; de la contaminación de las aguas de mar y de estuarios ; del ph y la temperatura en corrientes o lagos ; de la toxicidad de desperdicios industriales etc.(Palmer,1962). Su clasificación obedece según sus características estructurales como tipo de célula, reproducción de nutrición y tipo de pigmentos entre otros (Lee, 1992; Raven et al.1999, citados por Peña y otros, 2005).
Los protozoos son organismos unicelulares que poseen orgánulos rodeados de membrana, es decir; eucariontes (Ruppert y Barnes, 1995; Brauman, 2000; Madigan et al ,2000), agrega Solomon, et al; (2007) que los protozoarios son un grupo polifilético. Su nombre proviene del griego protos, primero y zoon, animal. Algunos son de estructura muy simple y otros complejos, con orgánulos (celulares) que sirven para determinados procesos vitales y funcionalmente son análogos a los sistemas de órganos de los animales pluricelulares. En la mayoría de los protozoos la reproducción es asexual. Simplemente la célula se divide para dar origen a dos organismos completos. Este tipo de reproducción de denomina fisión binaria (Roldan y otros; 1984; Ruppert y Barnes, 1995).
2. OBJETIVOS
• Observar, identificar y reconocer las diferencias morfológicas existentes entre los grupos de protozoarios (Ciliados, Flagelados y Rizópodos).
• Observar, identificar y reconocer las diferencias morfológicas existentes entre los grupos de algas (Clorofíceas, Cianofíceas, Crisofíceas, y Rodofíceas).
• Diferenciar organismos eucarióticos, unicelulares y coloniales dentro del grupo de los protozoos y algas
3. MARCO TEORICO
Las algas son organismos eucariontes (Lee, 1999); algunos son unicelulares, coloniales o filamentosas (Peña y otros, 2005), pluricelulares (Streble and Krauter, 1987). Todas ellas poseen plastidios, es decir corpúsculos capaces de dividirse que contienen pigmentos asimiladores. La división de las algas en clases se basa, entre otras cosas, en la composición de los pigmentos de los cloroplastos. Todas las algas poseen clorofila (verde), pero no todos los tipos de clorofila(a, b, c, d) se encuentran en las distintas clases de algas. Existen otros pigmentos, que alteran el color base de los cloroplastos, carotenos, xantofilas y raramente ficobilinas. No existe acuerdo entre los investigadores, referente a la clasificación de las algas. Sin embargo la mas aceptada es la siguiente: Clorofíceas (algas verdes), Rodofíceas (algas rojas), Crisofíceas (algas doradas), Cianofíceas (algas verde-azules).
Los representantes mas primitivos de las clorofíceas poseen un solo cloroplasto y ocupa toda la célula. Los tipos mas evolucionados poseen grandes vacuolas centrales, cloroplastos se hallan en posición marginal. Su pared celular esta compuesta de celulosa, poseen clorofila a y b. Ver figura No. 3
Figura No 1. A-Oedogonium sp(Alga verde) ,B-Spirogyra sp (Alga verde) C-Volvox (Alga verde)
(Universidad Nacional de Colombia, Escuela de Biociencias, Laboratorio de Biología).
Las algas rojas (rodofíceas) presentan células mononucleadas y casi siempre contienen varios cloroplastos, así como una gran vacuola que aplasta el citoplasma contra la pared celular. Poseen además de la clorofila a, y de diversos carotenoides, los cloroplastos de las algas rojas contienen dos pigmentos característicos: la ficocianina y la ficoeritrina.
Figura No 2. Batrachospermum. Alga roja (Rodofícea, con pigmento rojo ficoeritrina)
(Universidad Nacional de Colombia, Escuela de Biociencias, Laboratorio de Biología).
Las algas azules (cianofíceas) son unicelulares o filamentosas. Además de la clorofila a, todas las algas azules poseen un pigmento azul característico, la ficocianina. Algunas especies presentan además un pigmentos rojo (ficieritrina).También poseen xantofilas y carotenos.
Figura No 3. Nostoc .Alga verde azulada (Cianofíceas, con pigmento azul ficocianina)
(Universidad Nacional de Colombia, Escuela de Biociencias, Laboratorio de Biología)
Las algas Crisofíceas (algas doradas), carecen de clorofila b, contienen clorofila a (generalmente también c y e), aunque es enmascarada por otros pigmentos (xantofilas) por ello, el color de los cloroplastos de la mayoría de especies es pardo, amarillo o doradas, amarillo verdoso, amarillo o verde puro. (Streble and Krauter, 1987).
Entre los principales beneficio de las algas se tiene, actúan como fertilizantes en cultivos acuáticos, se hayan asociados a otros organismos (corrales, líquenes), usados en la alimentación humana, industria alimenticia (algas rojas).
Las células de las algas están compuestas por polisacáridos que son parcialmente producidos y secretados por el aparato de Golgi. El plasmalema se encuentra rodeando la célula, esta membrana es una estructura responsable de la entrada y salida de sustancias en la misma Presentan reproducción sexual y asexual, en el primero hay fusión de gametos para luego formar un cigoto (Lee, 1999).
Los protozoarios son organismos heterótrofos unicelulares, se clasifican en grupos principales. Los flagelados (Euglena). Sarcodinos (amebas), ciliados (Paramecio) estos contienen tanto miembros de vida libre como parásitos.
Figura No 4. Estructura de Euglena (Flagelado) (Tomado de www.biocab.org)
Figura No 5. Estructura del Paramecio (Ciliado) (Tomado de www.visualdictionarionline.com)
Los ciliados son considerados los protozoarios mas complejos, habitan aguas dulces o saladas y constan de organelos especializados llamados cilios.
Por lo general, el cuerpo de los protozoos solo esta rodeado por la membrana celular. Los órganos locomotores de los protozoos pueden ser flagelos, cilios o expansiones fluctuantes del cuerpo denominadas pseudópodos. La reproducción por fisión (reproducción asexual) es la mas común en la mayoría de los protozoos, cuando se este proceso resultan dos células hijas se denomina fisión binaria, cuando una célula hija es mucho mas pequeña que la otra, el proceso se denomina gemación (Ruppert and Barnes, 1996; Madigan, et al, 2000).
Figura No 6. Estructura de ameba (Rizópodo) (Tomado de www.carampangue.cl)
Los protozoos normalmente obtienen su alimento por ingestión de otros organismos o partículas orgánicas. La ingestión de macromoléculas o partículas en solución se denomina pinocitosis. Otro proceso utilizado por los protozoos es la fagocitosis, consiste en envolver e introducir a la célula, las partículas de alimento. Algunos producen enfermedades en humanos como lo son Tripanosoma sp (flagelado), produciendo la enfermedad del sueño, Ameaba sp, (rizópodo) la cual produce disentería, Plasmodium sp (Esporozoario), el cual produce la malaria (Madigan et al, 2000).
Figura No 7. Tripanosoma sp. (Flagelado) Figura No.6 Plasmodium sp. (Esporozoario) (Tomados de http://www.uprm.edu/biology/cursos/biologiageneral/MBlab4.ppt&usg y http://bp1.blogger.com/)
3. MATERIALES
Microscopios compuestos, agua estancadas o de florero, laminillas cubreobjetos Portaobjetos, goteros plásticos, ramas de elodea (pecera).
4. PROCEDIMIENTO
a. Observación de algas
Recoja agua de charcas, rió o de florero en un recipiente limpio con varios días de antelación. En el laboratorio, tome una pequeña gota del agua con la ayuda de un gotero, deposítela en una lámina portaobjetos y colóquele el cubreobjetos.
Existe otra forma de hallar algas de los grupos Crisofíceas, clorofíceas y cianofíceas y es realizando un raspado con una aguja de las hojas de elodea procedente de la pecera y colocándola sobre la placa portaobjetos, adicionarle una gota de agua estancada, luego el cubreobjetos y finalmente la observación al microscopio.
Inicie la observación en el objetivo de 4x, y luego con los otros aumentos. Pera la identificación de géneros solicite las claves y láminas utilizadas para tal fin. Realice las figuras y anotaciones necesarias de cada género encontrado. En todos los casos recuerde seguir las normas generales de laboratorio, utilizando guantes de látex en todo el transcurso de la práctica. Para la identificación de los diferentes géneros de algas y protozoos se cuenta con manuales, claves, laminas. Solicite ayuda a los encargados de dirigir la práctica.
b. Observación de protozoos
Cada especie vive en un ambiente húmedo particular: en el agua de mar o en el fondo del océano, en tierra, en las aguas dulces, salobres o corrompidas; en el suelo o en la sustancia orgánica en descomposición. Recoja agua de charcas, rió o de florero en un recipiente limpio con varios días de antelación. En el laboratorio, tome una pequeña gota del agua con la ayuda de un gotero, deposítela en una lámina portaobjetos y colóquele el cubreobjetos. Inicie la observación en el objetivo de 4x, y luego con los otros aumentos. Para la identificación de géneros solicite las claves(guías) y láminas utilizadas para tal fin. Realice las figuras y anotaciones necesarias de cada género encontrado.
5. CUESTIONARIO DE CONSULTA
A-¿Las algas son habitantes normales de que sitios?
B-¿Las células de las algas son de tipo?
C-¿De acuerdo a su alimentación, las algas son organismos?
D- ¿El cuerpo vegetativo de un alga se compone de que partes?
E-¿El pigmento que poseen todas las algas se denomina?
F-¿El pigmento que da color a las algas rojas se denomina?
G-¿El pigmento que da color a las algas pardas se denomina?
H-¿La reproducción en las algas es cual tipo?
I-¿La reproducción asexual de las algas se realiza a través de que orgánulos?
J-¿Los órganos sexuales de las algas se llaman?
K.-Cuántas especies de algas se conocen?
L- Señale al menos 5 características de cada uno de los grupos de flagelados, ciliados y rizópodos.
M- ¿La osmoregulación en los protozoos es realizada a través de que mecanismos?
N-¿La digestión en los protozoos es de que tipo? ¿Donde tiene lugar?
Ñ-Señale las principales enfermedades en humanos producidas por protozoos y su vector.
6. BIBLIOGRAFIA
BRAUMAN, R.2006. Microbiology. Alternate edition with Diseases body System. Ed. Pearson Benjamin Cummings. P. 348-354.
MADIGAN, M.T, MARTINKO, J.M; PARKER, J. 2000. Brock Biology of microorganisms. Prentice Hall. Ninth Edition. p. 725-729.
PEÑA S., E.J; PALACIOS P., M.L; OSPINA A., N. 2005. Algas como indicadoras de contaminación. Programa Editorial Universidad del Valle.164p.
LEE, R.E.1999. Phycology. Cambridge, University Press. Third Edition.614p
ROLDAN, G.; VELÁSQUEZ, L.F; MACHADO, T. 1984. Biología Integrada. Los seres vivos y su ambiente. Editorial Norma. Bogota, Colombia. 252p
RUPERT, E.E, BARNES, R.D. 1995. Zoología de los invertrevados. Ed. McGraw –Hill Interamericana. p 21-69.
STREBLE, H.; KRAUTER, D. 1987. Atlas de los Microorganismos de agua dulce. La vida en una gota de agua.Ediciones Omega, S.A. Barcelona.357p.
SOLOMON, E.P; BERG, L.R; MARTIN, D.W. 2007.Biología, Quinta edición. Mc Graw –Hill .1237p
TORTORA, G.J; BERDELL, R.F.; CASE, C.C.2007. Microbiology, an introduction. Ninth edition. Pearson Benjamin Cumminings. 361-385p
MAUSETH, J.D. 2003. Botany, an introduction to plant Biology. Third Edition. University of Texas, Austin. Jones and Bartlett Publishers, Sudbury, Massachusetts. 848p
Referencias electrónicas
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http://www.monografias.com/trabajos31/protozoos/protozoos.shtml.Consultado el 13 de Agosto de 2008.
http://www.biocab.org Consultado el 10 de Noviembre 2008
http://www.carampangue.cl Consultado el 10 de Noviembre 2008
PRACTICA DE HONGOS Y BACTERIAS
1. INTRODUCCIÓN
Las bacterias son miembros del reino monera, son unicelulares (Streble and Krauter, 1987), procarióticos (células sin núcleo, cloroplastos, mitocondrias) en su mayoría heterótrofas, obteniendo su energía al desdoblar moléculas orgánicas complejas (que contienen carbono), (Audesirk and Audesirk, 1996).
Los hongos son miembros del reino fungi, algunos son unicelulares (levaduras) pero la mayoría son multicelulares (Starr and Taggart, 2004) heterótrofos, ya sea saprobios o parásitos, se alimentan por absorción de sustancias orgánicas u inorgánicas disueltas (Curtis and Sue, 1993).
2. OBJETIVOS
• Reconocer algunas formas bacterianas de muestras vegetales (Singonium sp), cepas bacterianas y yogurt.
• Identificar las partes de algunos géneros fungosos de la clase basidiomicetes, Deuteromicetes, Chitriomycetes y Zigomicetes.
• Aprender a realizar montajes en fresco de hongos y bacterias
3. MARCO TEORICO
La clasificación de las bacterias es difícil debido a la reproducción generalmente asexual, y a que los registros fósiles son muy escasos (Audesirk and Audesirk, 1996), en tal sentido Streble and Krauter, (1987) afirma que la clasificación de las bacterias no puede basarse en la forma de las células, ya que presentan tan solo unos pocos tipos de formas; muchas especies totalmente distintas muestran formas iguales o parecidas. Sin embargo algunos microbiólogos colocan a las bacterias en dos categorías principales: La división eubacteria (verdaderas bacterias) y la arqueobacterias (bacterias antiguas), Solomon, et al, (2007).
Las bacterias presentan varias formas comunes, si son esféricas, se les llama cocos (Diplococos (dos individuos), estreptococos (cadenas largas), estafilococos (masas irregulares parecidos a racimos de uvas); las bacterias deforma cilíndrica o de barra, llamadas bacilos, otras son helicoidales cortas se les llama vibriones, y las cadenas helicoidales largas y rígidas se les denomina espirilos y espiroquetas si son cadenas flexibles (Solomon, et al, 2007).
La pared celular de las bacterias (Eubacterias) esta constituida por un compuesto de cadenas de azucares con enlaces cruzados de péptidos (cadenas cortas de aminoácidos) denominado peptidoglucano. La presencia de una membrana adicional externa, parecida en su estructura a la membrana plasmática permite dividir las bacterias en gram negativas, aquellas que no la poseen son gram positivas. Algunas bacterias responden a estímulos (tactismos), químicos (quimiotacticos), a la luz(fototacticos), o responden a campos magnéticos (magnetotacticas) todo ello gracias a la presencia de flagelos bacterianos, que le permiten desplazarse (Audesirk and Audesirk,1996).la reproducción bacteriana se lleva a cabo por medio de la división celular llamada fisión binaria(se producen copias idénticas de la original).Algunas bacterias transfieren el material genético desde una bacteria donadora hasta un recipiente durante un proceso que se llama conjugación bacteriana (Audesirk and Audesirk,1996). También se reproducen asexualmente por gemación o fragmentación, en la primera; una célula produce una protuberancia o yema, la cual aumenta de tamaño, madura y finalmente se separa de la célula madre. En la fragmentación, se forma n paredes dentro de la célula, la cual entonces se separa en varios nuevos individuos (Solomon, et al; 2007). Las bacterias desempeñan muchas funciones importantes para otras formas de vida. Participan en una fotosíntesis parecida a la producida por las plantas (Bacterias verde-azules), o cianobacterias, otras obtienen su energía de reacciones que combinan con el oxigeno con moléculas inorgánicas como el azufre, amoniaco, o los nitritos (quimiosintetizantes) en este proceso liberan sulfatos o nitratos necesarios para las plantas. En otros casos se establecen asociaciones con animales, plantas. En el primer caso, las bacterias viven en el tracto digestivo de rumiante y ayudan a liberar los nutrimentos de los forrajes vegetales que el animal no puede separar por si solo; la segunda reviste importancia ecológica y económica debido las bacterias fijan nitrógeno en nódulos especializados de las raíces de plantas como alfalfa, soya, lupino, trébol, maní forrajero. La bacteria captan el gas nitrógeno (N2, que la planta no puede utilizar en forma directa) del aire atrapado en el suelo y lo combinan con el hidrogeno para producir amoniaco (NH4 +), un nutrimento importante para la plantas. También son importantes en la producción de alimentos para los seres humanos, como el queso, yogurt y en el envejecimiento de la carne. Las bacterias poseen una gran variedad de formas y estructuras, generalmente están encapsuladas en una pared celular rígida y da las formas características (Audesirk and Audesirk, 1996).
Figura No 1. Formas bacterianas. (Tomado de www.infoescola.com/images)
Muchos hongos son simbiontes, esto es; establecen relaciones con otras especies que viven juntas y tienen interacciones cercanas. Los líquenes y micorrizas son un ejemplo de simbiosis.
Los principales grupos de hongos se tienen los zigomicetos (Zigomycota), hongos saculares o ascomicetos (Ascomycota), Basidiomicetos (Basiodiomycota); Chytridiomycota (Hongos primitivos) y otro considerado como imperfectos llamados Deuteromicetos (Deuteromycota) (Solomon, et al, 2007; Starr and Taggart, 2004).
Figura No 2 .Hongo Deuteromicetes. Esporas de Diplodia spp.(W.Guerrero, Lab.de Biología, U. Nal de Colombia, Sede Medellín).
Los hongos son heterótrofos, es decir requieren de compuestos orgánicos sintetizados por otros organismos. La mayoría son saprofitos, y toman nutrientes de la materia orgánica sin vida provocando su descomposición. Otros son parásitos y extraen nutrientes de los tejidos de huéspedes vivos (Starr and Taggart, 2004).
Un filamento fúngico se llama hifa (filamentos en forma de hilos) y el conjunto de ellas se llama micelio (Audesirk and Audesirk, 1996; Starr and Taggart, 2004) y con núcleos en el interior que se dividen por mitosis (Starr and Taggart, 2004).Las hifas de algunos hongos no constan de células únicas alargadas (cenociticas) con varios núcleos (Solomon, et al, 2007), pero otros se dividen en muchas células llamadas septos (Audesirk and Audesirk, 1996).
Las paredes de la hifa esta constituida por quitina (polisacárido no presente en las plantas pero si en insectos y artrópodos) (Curtís and Sue, 1993). La reproducción de los hongos puede ser tanto sexual como asexual (ocurre por fragmentación de las hifas, formando cada una otro individuo) o bien por producción de esporas. Estas últimas son producidas en hifas especializadas llamadas esporangioforo (Curtis and Sue, 1993).
Figura No 3 .Hongo Deuteromicetes. Esporas y conidioforo de Fusarium spp. (W.Guerrero, Lab.de Biología, U. Nal de Colombia, Sede Medellín).
Figura No 4. .Hongo Deuteromicete. Esporas y conidioforo de Helminthosporium sp. (W.Guerrero, Laboratorio de Biología, U. Nacional de Colombia, Sede Medellín).
La mayoría de los hongos se reproducen por medio de esporas microscópicas, estructuras reproductivas inmóviles, dispersadas por el viento, agua o animales (Solomon, et al, 2007). Las esporas asexuales se originan por mitosis y se denominan: Zoosporas y conidias. La primera es una espora unicelular, asexual y móvil (posee flagelos), la segunda son uni o multiceluladas y no son móviles. La reproducción sexual, las hifas de dos tipos conjugantes genéticamente compatibles se reúnen y sus citoplasmas y núcleos se fusionan, formando una célula diploide conocidas como cigoto (Solomon, et al, 2007). Algunos representantes de los Deuteromicetes, se presentan a continuación en la figura No1., donde se pueden identificar las estructuras asexuales de los hongos llamadas conidias, sostenidas por el conidioforo (Figura No, B-C)
Las principales características de los grupos del reino fungi se presentan en la siguiente tabla 1.
Tabla.No1. Las principales divisiones de los hongos según Audesirk and Audesirk, 1996 y Solomon,et al;2007)
Nombre común (División) Reproducción sexual Reproducción asexual Características celulares Géneros representativos
Hongos zigomicetos(Zigomycota) Zigosporas Se forman esporas inmóviles en esporangio Pared celular con quitina, sin septo Rhizopus(moho del pan )
Hongos tipo saco (Ascomycota) Ascosporas Conidias se forman del conidioforo Pared celular con quitina, con septos Saccharomyces(levadura)
Hongos tipo clava (Basidiomycota) Basidiosporas poco común Pared celular con quitina, con septos Amanita (Champiñón venenoso),Polyborus(hongo de repisa)
Hongos imperfectos
(Deuteromycota) No presentan Conidias Pared celular con quitina, con septos Penicillium sp(produce la penicilina)
Hongos Chytriomicetos
(Chytridiomycota) Zoosporas Gametos flagelados en algunos quitridios Pared celular con celulosa, con o sin septo Allomyces
Para lograr el crecimiento de las bacterias y hongos es común utilizar recipientes bajo ambientes adecuados denominados cámaras húmedas, las cuales tienen como propósito crear condiciones favorables de humedad para el desarrollo rápido de hongos o bacterias. Esta se prepara con recipientes de vidrio, plástico que permita la sufriente aireación adecuada respiración y aumente la proliferación del microorganismo. Generalmente, se realizan cortes de los frutos, u otras muestras dejándolos expuestos al ambiente por uno o dos días y luego se encuban por seis o siete días, junto a una motita de algodón húmedo. (Ver figura No 4.)
Figura No 4. Método de incubación de muestras para el crecimiento de hongos.
4. MATERIALES
Microscopios compuestos, cepas bacterianas., Agujas enmangadas, azul de metileno o Azul de algodón, Frutos trozados de naranja, manzana, pera, pan, arepa, etc. contaminados, hojas de singonium sp (para obtener bacterias), yogurt, placas portaobjetos, cubreobjetos.
5. PROCEDIMIENTO
Primera actividad: montaje de hongos
Retire la tapa o envoltura de la bolsa (cámara húmeda), retire los frutos, o material que se le haya solicitado y realice raspados de cada una de las zonas donde crecieron los hongos,con la ayuda de las agujas enmangadas. Deposite el hongo en una lámina portaobjeto, agregue una gota de azul de metileno, coloque la lámina cubreobjetos. Finalmente, realice las observaciones al microscopio para su identificación.
Cuando se realizan montajes en fresco de hongos, también es posible aislarlos adhiriendo cinta transparente a la colonia fungosa, y pegando esta sobre una placa portaobjetos. Esta técnica tiene como finalidad identificar todas las estructuras (conidias, conidioforo, etc) del hongo en estudio. Realice las observaciones y esquemas en 10x, 40x.
Segunda actividad: Aislamiento y montaje de bacterias
Para la identificación de bacterias presentes en yogurt, se procede de la siguiente manera, tome una gota y deposítela en una placa portaobjeto adicione otra gota de alcohol absoluto para eliminar la grasa, coloque el cubre objeto y lleve al microscopio. Compare las formas bacterianas presentes en la muestra con la figura No 1.
Cuando se trabaje con cepas bacterianas crecidas en medio de cultivo (agar nutritivo), se toman colonias con la ayuda de una asa y siguiendo el mismo procedimiento anterior. Realice las observaciones y esquemas en 10x, 40x.
6-CUESTIONARIO DE CONSULTA
A- Mencione al menos 3 usos de los hongos a nivel industrial, y farmaceutico.
B- Mencione 3 enfermedades ocasionadas a igual número de cultivos de importancia económica, nombre su agente causal.
C- Consulta 3 géneros de hongos y tres de bacterias asociados al control biológico de insectos, animales.
D- Las estructuras reproductoras sexuales de los basidiomicetos, ascomicetes, zigomicetes se denominan?
E- Nombre 3 casos especificos de simbiosis entre hongos y algas o bacterias, y hongos y raíces de plantas
F- Describa brevemente como ocurre la fijación de nitrógeno realizada por las bacterias.
G- Cual es la importancia ecologica de las bacterias.
H- Señale al menos 5 diferencias entre eubacterias y arqueobacterias. De ejemplos.
I- Metabolicamente las bacterias se dividen en cuales grupos? ¿La tasa de reproducción de bacterias/minuto es?
J- Registre por lo menos 3 enfermedades y su agente causal (genero) causadas por bacterias en humanos.
k- Las principales toxinas producidas por hongos en los cereales se denominan? Que enfermedad produce en humanos?
L -Mencione 5 toxinas producidas por hongos. Que otro nombre reciben este tipo de toxinas?
M- Tradicionalmente los hongos se clasifican en saprobios y parásitos, mencione la clasificación de los hongos en términos de su hábitat y su relación con el suelo o la planta.
N- Investiga cuales son los principales metabolitos producidos por los hongos.
Ñ-Se sabe que la reproducción sexual en hongos ocurre gracias a la unión de la gameto masculino y otro femenino para formar el cigoto y posteriormente la espora sexual. ¿La reproducción sexual ocurre a través de que procesos? ¿En que consiste cada uno de ellos?
7. BIBLIOGRAFIA
CURTIS, H.; SUE BARNES N. 1993.Biología. Quinta edición. Editorial Medica Panamericana S.A. Buenos aires-Argentina.1188p.
AUDESIRK, T.; AUDESIRK, G. 1996. Biología, La vida en la tierra. Prentice-Hall Hispanoamericanaza. México.947p
STREBLE, H., KRAUTER, D, 1987. Atlas de los microorganismos de agua dulce. La vida en una gota de agua.337p
STARR, C.; TAGGART, R. 2004.Biología. La unidad y diversidad de la vida. Décima edición Editorial Thomson. 933p.
SOLOMON, E.P.; BERG, L.R.; MARTIN, D.W. 2001. Biología .Quinta Edición. Mc Graw –Hill Interamericana. 1237p.
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Referencias electrónicas
www.infoescola.com Consultado el 10 de Noviembre de 2008.
PRACTICA CELULAS ANIMALES Y VEGETALES
1. INTRODUCCIÓN
Curtis y Sue (2000), consideran la célula como una unidad autónoma y, al menos parcialmente independiente, esta rodeada por una membrana que controla el paso de sustancias hacia el interior y exterior de la célula, para Starr y Taggart (2004) la célula es la unidad más pequeña que retiene las características de la vida. Agregan Curtis y Sue (2000), que la mayoría de las células que constituyen el cuerpo de una planta o de un animal miden entre 10 y 30 micrómetros de diámetro.
En la presente practica se identificaran algunas diferencias y similitudes en células vegetales como de cebolla (Allium sp), tradescantia , elodea, tomate (Lycopersicum esculentum), papa (Solanum tuberosum) y células animales como tejido epitelial de cavidad bucal, espermatozoides bovinos, células adiposas, células sanguíneas y oocitos bovinos.
2. OBJETIVOS
• Determinar las diferencias morfológicas entre diversos tipos de células animales, vegetales.
• Comprobar que las células, tanto vegetales como animales, poseen tamaños y formas variables.
• Establecer que, de acuerdo con el nivel de organización, existen dos tipos de células: procarióticas y eucarióticas.
3. MARCO TEORICO
Según lo expresado por Curtis y Sue (2000) y Starr and Taggart(2004), las células animales y vegetales presentan algunas diferencias y similitudes, entre las diferencias se destaca, en la célula vegetal además de la membrana celular, presenta pared celular compuesta de celulosa y otros polisacáridos, la presencia de plastidios en la célula vegetal, constituye una de las grandes diferencias con respecto a la célula animal, las vacuolas grandes en células vegetales(ocupa gran parte de la célula) y vacuolas pequeñas o ausentes en células animales es otra diferencia importante en los dos grupos. Las similitudes se tienen la presencia de ribosomas, mitocondrias, núcleo, nucleolo, complejos de Golgi.
Para González y Spinel (2004), según la complejidad de la ultraestructura celular los organismos se dividen en procariontes y eucariontes. Los primeros o prenucleares, se caracterizan por carecer de organelos con unidad de membrana tales como núcleo, mitocondrias, cloroplastos, aparato de Golgi etc. como lo son las bacterias. En el grupo de los eucariontes están los hongos, las algas, los protozoarios y demás organismos superiores vegetales y animales.
La principal restricción al tamaño de la célula es la que impone la relación entre el volumen y la superficie, esto es, en células grandes, la relación superficie /volumen es menor que en células pequeñas, lo que significa que las células grandes disponen de una superficie de intercambio con el medio ambiente proporcionalmente menor. Una segunda limitación al tamaño de una célula eucariótica parece estar relacionada con la capacidad del núcleo –centro de control de la célula-para suministrar suficientes copias de moléculas con la información necesaria para regular los procesos que ocurren en una célula grande, metabolicante activa (Curtis and Sue, 2000).
Entre las células vegetales con las que se trabajara se tienen: células de tradescantia, donde podemos identificar el aparato estomático, las células epidérmicas etc. como aparece en la figura No 1.
Figura No 1. Células de tradescantia.
En células de cebolla (Allium sp) se identifican la pared y membrana celular (ver figura No 2)
Figura No 2. Células de cebolla (Allium sp).
Se trabajara con células de papa (amiloplastos), un tipo de plastidios (leucoplastos) incoloros característico de células vegetales, se caracterizan por almacenar almidón, en ocasiones proteínas o aceites (Curtis and Sue, 2000). Ver figura No 3.
Figura No 3. Células de papa (amiloplastos).
Finalmente, se incluye otro tipo de plastidio llamado cromoplasto (chromo significa color), el cual contiene pigmentos y son responsables de los colores naranja y amarillo brillante de las frutas, las flores y zanahorias (Curtis and Sue, 2000).ver figura No 4.
Los tejidos animales se componen de células parecidas que realizan una función específica, tal es el caso del tejido epitelial que forma membranas que cubren el cuerpo y limita sus cavidades. Las células de los tejidos epiteliales son llamados epitelios, forman capas continuas denominadas membranas (Audesirk and Audesirk, 1996). Ver figura No 5.
Figura No 4. Células de tomate (cromoplastos).
Figura No 5 .Epitelio de cavidad bucal.
Las células grasas llamadas en conjunto tejido adiposo, son células modificadas para actuar cono sacos de almacenamiento de triglicéridos (Niemeyer, 1978; Audesirk and Audesirk, 1996).), moléculas utilizadas para el almacenamiento de energía a largo plazo. Los triglicéridos representan el 90% del volumen de las células adiposas (Audesirk and Audesirk, 1996). Ver figura No 6.
Figura No 6.Células adiposas (Tomado de www.telmeds.org)
Estas células se caracterizan por ser grandes, esféricas, que por contacto mutuo se deforman adquiriendo entonces formas poligonales, de contornos irregulares. La mayor parte de las células está ocupada por una sóla gota de lípido, El núcleo está desplazado hacia un costado y el citoplasma está reducido a un delgado borde.
Para Audesirk and Audesirk, (1996) la sangre y la linfa se consideran tejidos conectivos debido a que están compuestos principalmente de líquido extracelular, de plasma y linfocitos, respectivamente. La porción celular de la sangre consta de eritrocitos y leucocitos y fragmentos celulares llamados plaquetas. La sangre lleva oxigeno disuelto y otros nutrimentos a la célula y recoge bióxido de carbono y otros productos de desecho celular. Ver figura No 7.
Figura No 7 .Componentes de la sangre (Tomado de http://iescarin.educa.aragon.es/depart/biogeo/varios)
Los ovarios son el sitio de producción de los óvulos, las cuales en las hembras son producidas por células precursoras llamadas ovogonias, y el proceso de formación de óvulos se denomina ovogénesis. Alrededor de cada ovario se encuentra una capa de células mucho más pequeñas que nutren al ovocito en desarrollo y secretan hormonas que nutren al ovocito en desarrollo y secretan hormonas sexuales femeninas. En conjunto el ovocito y estas células accesorias conforman el folículo Audesirk and Audesirk, (1996). El ovocito primario sufre la primera división meiotica (interrumpida durante su desarrollo) para convertirse en ovocito secundario y un cuerpo polar, que es algo mas que un juego de cromosomas de desecho. Ver figura No 8.
Figura No 8. Microfotográfia de ovocitos bovinos inmaduros y maduros. (Cortesía Prof.Neil Vásquez Araque)
4. MATERIALES
Microscopio, Portaobjetos, Cubreobjeto, jeringas hipodérmicas, Mechero de alcohol Lanceta estéril, cubeta de tinción, cuchillas de afeitar nuevas, cajas pequeñas de petri, Palillos de dientes, Frasco lavador, alcohol absoluto, Eosina, azul de metileno, rojo sudan III, Hematoxilina,lugol, mecheros, hojas de elodea, tradescantia, cebolla cabezona, cortes finos de papa, tomate, tocino graso, muestra de sangre, oocitos bovinos, pajilla de semen bovino.
5. PROCEDIMIENTO
Primera actividad: Observación de células vegetales
• Células de cebolla (Allium sp): Tome con cuidado varias hojas de cebolla y, retire la delgada capa (epidermis) que esta adherida a ellas. Deposítelas en una placa portaobjetos, evitando que se enrollen y agregue una gota de azul de metileno u otro colorante que se le indique. Finalmente coloque el cubreobjetos y realice las observaciones y esquemas en diferentes aumentos.
• Células de tradescantia: Se procede de la misma forma que la cebolla, pero sin agregar ningún colorante a la muestra. Realice las observaciones y esquemas en diferentes aumentos.
• Células de Elodea (Egeria densa): Desprenda una o dos hojitas de la rama y, colóquela sobre el portaobjetos, agréguele una gota de agua, el cubre objetos y realice las observaciones en diferentes aumentos.
• Células de papa (Solanum tuberosum): Realice varios cortes (finos) de escasos micrómetros con la ayuda de cuchillas de afeitar nuevas, parte de esos cortes deposítelos en una caja petri con agua y agrégueles azul de metileno u otro colorante que se indique, el resto agrégueles directamente el colorante lugol. Realice las observaciones y esquemas en diferentes aumentos.
• Células de tomate (Lycopersicum esculentum): Retire un trozo pequeño de pulpa de tomate con la ayuda de un bisturí o cuchilla de afeitar, deposítelo en el portaobjeto y cubralo con el cubreobjetos. Haga las observaciones y esquemas en diferentes aumentos.
Segunda actividad: Observación de células animales
• Células de epitelio bucal: Con la ayuda de un palillo de dientes, realice un frotis de la cavidad interna de la mejilla, deposite el raspado sobre la lámina portaobjetos y haga un extendido sobre la misma. Adicione una gota de azul de metileno y coloque la laminilla cubreobjetos. Anote las observaciones y dibuje los esquemas en diferentes aumentos. Finalizada la observación deposite las placas en el recipiente de riesgo biológico (guardián) que hay en el laboratorio.
• Células de tejido graso: Tome una cuchilla de afeitar o bisturí, y haga un raspado sobre el tejido graso, deposítelo en el portaobjeto y agréguele rojo sudan III. Anote las observaciones y dibuje los esquemas en diferentes aumentos.
• Células de reproductivas (Ovocitos): Realice succión de oocitos del ovario, con la ayuda de agujas hipodérmicas y deposítelos en cajas petri pequeñas y llevarlos al estereomicroscopio para su identificación. Esquematice lo observado en diferentes aumentos.
• Células de sanguíneas: Para esta actividad es necesario un donante. Se procede de la siguiente manera: desinfecta con alcohol y algodón el área (punción en dedo, o vena del brazo), sin pasar dos veces por el mismo sitio (para evitar infecciones). Obtenida la muestra de sangre, deposite una gota sobre una placa portaobjetos y con la ayuda de otra placa, realice un extendido de la misma, adiciónele el colorante wrigth, procurando distribuir el mismo en toda la placa. Ver figura. Luego, pase el portaobjeto por el mechero, haciendo varias pasadas sobre la flama (evitar quemar las células). Realice las observaciones y esquemas de la muestra, donde se observarán predominantemente glóbulos rojos.
Figura No 9. Forma en que se realiza el extendido de sangre.
6. CUESTIONARIO DE CONSULTA
A-Al Identificar las diferentes partes de las células animales y vegetales observadas, notamos algunas diferencias? Explique
B-En que etapa de formación del eritrocito desaparece el núcleo del mismo?
C-Mencione la hormona encargada de la producción de glóbulos rojos en la sangre y el lugar donde se produce.
D-Escriba al menos una función de cada uno de los componentes celulares de la sangre.
E- ¿Que función desempeñan los plastidios en los vegetales? ¿Qué tipo de plastidios se conocen? ¿Es posible identificar plastidios en células animales? Explique.
F- Se sabe que las grasas o triglicéridos son las sustancias más abundantes en la naturaleza. ¿En que órganos de las plantas y animales las podemos encontrar?. ¿Que papel desempeñan y en que proporción están en nuestro organismo?
G-El almidón no es una sustancia simple, y esta compuesta por cuales proteínas?
H-Es bien sabido, que el 95% del peso seco del eritrocito maduro hemoglobina; el 5 % restante esta reprensado en que estructuras o sustancias?
I-Mencione las principales características que presenta el epitelio de cavidad bucal.
J- Escriba los principales tipos de tejido epitelial, sus propiedades, función y ubicación en el cuerpo.
K-La hormona que estimula el desarrollo de folículos se denomina?
L-La hormona encargada de la producción de eritrocitos se denomina?
M-La función de las células de guarda es? En que se diferencia de las células epidémicas contiguas a ella?
N- Que papel cumplen las células oclusoras del estoma en la planta?
Ñ-El tejido epitelial de la boca es de que tipo de tejido?
7. BIBLIOGRAFIA
CURTIS H., SUE, N.B. 2000.Biología.Editorial Medica Panamericana.6ª edición 126-127.
GONZALEZ, T.; SPINEL C.2004. Practicas de laboratorio: Biología Celular. Notas de clase .Facultad de Ciencias. 87p.
AUDESIRK, T.; AUDESIRK, G. 1996. Biología, La vida en la tierra. Prentice-Hall Hispanoamericana-. México.947p
STARR, C.; TAGGART, R. 2004.Biología. La unidad y diversidad de la vida. Décima edición Editorial Thomson. 933p.
NIEMEYER, H., 1978.Bioquímica. Universidad de Chile. -Volumen II. 2da edición, Editorial Intermedica s.ai.ci Buenos aires
Argentina
Referencias electrónicas
http://iescarin.educa.aragon.es/depart/biogeo/varios/BiologiaCurtis/Seccion%207/42-5.jpg.
PRACTICA ESTUDIO DE LA HOJA
1. INTRODUCCIÓN
Las hojas como todos los órganos de la planta, cumple funciones específicas. La función principal de éstas es la fotosíntesis, sin embargo puede realizar otras funciones en la planta. Durante la fotosíntesis, las hojas absorben el dióxido de carbono y lo convierten en carbohidratos con el uso de la energía solar. El proceso de fotosíntesis se lleva a cabo en los organelos denominados cloroplastos, donde se encuentran los pigmentos encargados de utilizar los fotones de luz para producir energía química.
2. OBJETIVOS
• Identificar morfológicamente y anatómicamente las partes de hojas monocotiledóneas y. dicotiledóneas.
• Ilustrar el proceso de sucesión foliar en algunas especies de angiospermas.
• Clasificar algunas hojas de plantas según su forma, complejidad, filotaxia y pecíolo.
• Reconocer algunas modificaciones foliares (Cotiledones, Bracteas, catáfilos, epicaliz, espinas foliares, filodios).
3. MARCO TEORICO
Beck, (2005) sostiene que las hojas son láminas aplanadas que presentan dos mitades bien definidas (simetría bilateral o simetría dorsoventral); con crecimiento limitado y definido para cada especie (Uribe, 1966). Aclara Izco y colaboradores, (2004) como el termino hoja se aplica, en un sentido amplio, a briofitas, pteridofitas y plantas con flores. Pero es necesario diferenciar correctamente las expansiones laminares de briofitas, que tienen origen gametofitito y, por ello, no son homólogos de las pteridofitas y antofitas en las que proceden del esporofito; para las briofitas es mas correcto usar el termino filodio. En helechos es común el uso de fronde para referirse a las hojas. La hoja es un órgano extremadamente variable y ha sido objeto de estudios desde el punto de vista morfológico y anatómico con fines taxonómicos, en todos los casos la tipología y terminología referidas a la hoja son extensas, agrega Izco y colaboradores (2004) que en plantas son frecuentes los términos que hacen referencia a la disposición ordenada de las hojas en las yemas, la foliación, la forma de los plegamientos en ellas.
Desde el punto de vista morfológico una planta consta de las siguientes partes: base de la hoja, nervadura principal, nervaduras secundarias, ápice, margen, limbo, pecíolo, estipulas, pulvinulo, foliolo, raquis (Becerra y otros, (2002); De la Cruz (2000). (Ver figuras No 1 y 2).
Morfológicamente, las hojas presentan una complejidad enorme; por esta razón es necesario clasificarlas de acuerdo a la forma de la lamina foliar, ápices, y de la base de la hoja (Figura No 6). Según la complejidad de las hojas pueden ser simples o compuestas, la primera referida a las que tienen un solo limbo foliar (Figura No1) y las segundas mas de un limbo, en este ultimo caso cada limbo se llama foliolo, en la hoja compuesta la parte desprovista de foliolos se denomina pecíolo y la tiene los foliolos se llama raquis (figura No 3).
Figura No 1 .Partes de Hoja simple. Citrus sp (W. Guerrero, U. Nacional de Colombia, Sede de Medellín, Lab.Biologia)
Figura No 2. Hoja compuesta. (W. Guerrero, U. Nacional de Colombia, Sede de Medellín, Lab.Biologia)
En el grupo de las compuesta encontramos varios tipos a saber: Palmado compuestas, si todos los foliolos salen del mismo punto del pecíolo; Pinado compuestas , si los foliolos salen a lo largo del raquis a modo de peine, este grupo se divide en paripinada si el extremo del raquis termina en dos foliolos(el guamo) y es imparipinada si el raquis termina en un solo foliolo(la rosa),la recompuestas o bipinadas, si el raquis se ramifica dos o mas veces y los foliolos se insertan en las ramificaciones(El carbonero, figura No 3 ).
La forma como se disponen las hojas en el tallo se denomina filotaxia, Velásquez y Sánchez (2008) las clasifican en opuestas disticas, doblemente opuestas, verticiladas, alternas disticas, roseta basal, alterna espiralada (Figura No 7).
Figura No 3. Hoja recompuesta. (W. Guerrero, U. Nacional de Colombia, Sede de Medellín, Lab.Biologia)
En las hojas se distinguen dos tipos de nervaduras: la paralela y la reticulada. La paralela se presenta cuando la nervaduras principales son paralelas entre si, desde la base hasta el ápice y es característico de las hojas monocotiledóneas (caña de azúcar, pastos, maíz). En La reticulada se ramifican las nervaduras se ramifican muchas veces, a modo de red en todo el limbo y es característico de las hojas dicotiledóneas (Rosa, San Joaquín, búcaro).
Internamente, el sistema vascular esta encerrado por el mesófilo parenquimatoso, el cual a su vez esta rodeado por la epidermis (Beck, 2005). El mesófilo es el tejido fotosintético primario en hojas dicotiledóneas, y esta compuesto predominantemente por parénquima*, sin embargo alrededor de la margen foliar y del tejido vascular es posible encontrar células de Esclerenquima* y / o Colenquima *.El mesófilo de angiospermas se divide una región alta y región baja. La primera esta conformada por el mesófilo de empalizada, que consiste en células elongadas, tubulares; la segunda región, o mesófilo esponjoso, esta compuesto por células de forma irregular, y con espacios y canales entre ellas; este tejido usualmente es denominado Aerenquima. La epidermis de la hoja esta compuesta de tejido parénquima tico con espacios celulares, excepto las cavidades estomáticas (Beck, 2005). (Ver figuras No 4 y 5).
Figura No 4. Anatomía de hoja monocotilidedonea .400x (W. Guerrero, U. Nacional de Colombia, Sede de Medellín, Lab.Biologia).
Figura No 5. Anatomía de hoja Dicotiledónea. (W. Guerrero, U. Nacional de Colombia, Sede de Medellín, Lab.Biologia)
Figura No 6. Terminología empleada en la descripción de la lamina foliar (Tomado de Luque y otros____)
Figura No 7. Terminología empleada en la disposición de las hojas en el tallo (Tomado de Velásquez y otros, 2008)
Todos los tipos de hojas que aparecen en una planta se denominan filoma, los cuales presentan diversidad en la estructura interna y externa, los filomas han sido clasificados en: Nomófilos, catáfilos, Hipsófilos, cotiledones y antófilos. (Luque y otros, ______).
A partir de la germinación y desarrollo de la planta aparecen diversos tipos de hojas:
1-Cotiledones u hojas del embrión de forma simple o en algunos casos convertidos en órganos de reserva.
2- Hojas primarias de forma simple y tamaño pequeño.
3-Nomófilos u hojas normales de mayor complejidad y tamaño, son las más abundantes.
4- Hipsófilos hojas de menor complejidad y tamaño que los anteriores, desarrolladas en la parte superior de la planta cuando llega al estado reproductivo, son ejemplos de ellos las bracteas (en cuya axila nacen las flores), las bractéolas (hojas reducidas que nacen en el pedúnculo de las flores o en le eje lateral de las inflorescencias).
5-Antófilos u hojas especializadas que constituyen los elementos de la flor: sépalos, pétalos, estambres y carpelos (Becerra y otros, 2002).
En cuanto a modificaciones foliares se tienen:
• Los cotiledones o embriofilos, su función según lo expresa Uribe (1998) es digerir, absorber y almacenar sustancia del endospermo para alimentar la planta.
• Las bracteas o Hipsófilos, se ubican próximas a las flores; como es el caso del curazao; las externas corresponden a bracteas petaloides, que atraen insectos (Uribe ,1998).
. Figura No 7. Sucesión foliar (Luque y otros ____)
Figura No 7. Modificaciones foliares. Estípulas en fríjol (Phaseolus vulgaris)
Figura No 8. Modificaciones foliares. Filodios en hojas de Guamo (Inga sp)
Figura No 9. Modificaciones foliares. Espinas foliares en hojas euforbiácea
4. MATERIALES
Estéreo microscopios, Microscopio, Cuchillas, Azul de metileno, hojas de Dicotiledónea (Codiaeuim variegatum, Croto; Citrus spp, Naranjo, Murralla paniculata, Ficus Bomba, Azahar de la india; Calliandra haematocefala, Carbonero; Mangifera indica, Mango), Hojas de Monocotiledóneas (Lilium sp, Lirio; Sacharum oficinarum, Caña de azúcar, cinta), Porta y cubreobjetos.
5. PROCEDIMIENTO
Primera actividad. Morfología foliar:
• Detalle y esquematice las partes de las hojas (monocotiledóneas y dicotiledóneas) que se le suministren.
• De ser necesario, utilice los estéreomicroscopios para la observación.
Segunda actividad. Anatomía foliar:
• Deposite agua en una caja petri, agréguele una gota de azul de metileno.
• Tome una cuchilla nueva, y realice cortes transversales muy finos de las hojas que se le suministren.
• Sumerja los cortes de hoja en la caja petri. Espere algunos minutos para la tinción de los tejidos.
• Retire uno dos cortes, y colóquelos en un portaobjetos, mas otra gota de azul de metileno
• Coloque el cubreobjetos. realice los esquemas y anotaciones necesarias en los diferentes aumentos.
Tercera actividad. Sucesión foliar:
• Identifique y realice los esquemas de las plantas suministradas.
• Indique las tipos de hojas con base en el proceso de sucesión foliar (cotiledones, hojas primaras, Nomófilos, Hipsófilos y antófilos) que se le suministren.
Cuarta actividad: Complejidad de la lamina foliar
• Realice la clasificación de la hoja suministrada, con base en su complejidad, forma de la lámina, del ápice y base de la lámina.
• Plasme en su libro de notas los esquemas de cada una de las muestras suministradas
Quinta actividad: Modificaciones foliares
• Dibuje y clasifique las modificaciones foliares presentadas
• Identifique sus partes en la planta.
6. CUESTIONARIO DE CONSULTA
A. Enumere y explique 6 funciones generales de las hojas.
B-Como se denomina el lugar de donde se origina la hoja?
C- Que tipo de tejidos componen la hoja y que papel desempeñan?
D. ¿Que característica fundamental presentan las células epidérmicas del estoma?
E- El tejido mas importante en la hoja desde el punto de vista productivo y de almacenamiento de sustancia se llama? Que tejidos están involucrados?
F- Las hojas de las semillas también se denominan?
G-Mencione (4) aspectos importantes de las hojas desde el punto de vista económica.
H- Investiga otros tipos de modificaciones foliares y anótalos en el informe.
I-Escribe algunos ejemplos de hojas con función de almacenamiento.
J-El parénquima se define como? Y su función es?
K-El meristemo fundamental hace parte de que tejido? Cuales tejidos origina? Es diferente del tejido fundamental? En que se diferencian?
L-Que es un primordio foliar?
M-Cual es el significado del rastro foliar? A que se asemeja?
N-Con base en la anatomía foliar. Como podríamos diferenciar una planta monocotiledónea y otra dicotiledónea?
7. BIBLIOGRAFIA
BECK, CH. 2005. An Introduction to Plant Structure and Development. Cambridge, University Press
. P316-349.
BECERRA, N.; BARRERA, E.; MARQUINEZ, X. 2002.Anatomía y morfología de órganos vegetativos de las plantas vasculares. Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogota. Facultad de Ciencias, Departamento de ciencias.276p.
MAUSETH, J.D. 2003. Botany, an introduction to plant Biology. Third Edition. University of Texas, Austin. Jones and Bartlett Publishers, Sudbury, Massachusetts. 848p
LARCHER, W. 2003. Physiological Plant Ecology. Ecophysiology ND Stress Physiology of Functional Groups. Fourth Edition. Springer. 512p
LUQUE, R.; RICO, R.; LEON, Y.; ESTRADA, J. _______.La hoja. Morfología externa. Universidad de los Andes. Centro Jardín Botánico. Venezuela.
DE LA CRUZ, G. A. 2000.Morfología Vegetal. Universidad Nacional de Colombia, Sede Palmira. Departamento de Ciencias Básicas. 96p
IZCO,J.,BARRENO,E.,BRUGUES.M.,COSTA,M.,DEVESAJ.A,FERNANDEZ.F.,GALLARDO,T.,LLIMONA,X.,PRADA,C.,TALAVERA,S.,VALDES,B. 2004. Botanica. Segunda edicion .McGraw-Hill Interamerican. P 87-92
URIBE, A.F. 1988. Botánica General. Serie Biología. Facultad de Educacion, Universidad de Antioquia.336p.
PRACTICA ESTUDIO DE LA FLOR
1. INTRODUCCIÓN
Las angiospermas o plantas con flores comprenden los vegetales más desarrollados y más numerosos. Estas plantas poseen estructuras muy diferenciadas para la función reproductora que reciben el nombre de flores (Roldan y otros, 1984). Sostienen (Luque y otros, (____), Uribe, 1965; Beck, 2007) que las flores se pueden definir como vástagos (tallos) de crecimiento determinado en el que las hojas están diferenciadas para la reproducción sexual o conjunto de órganos sexuales rodeados por bracteas mas o menos vistosas propia de plantas superiores (Izco y otros,1997). En su forma mas simple implica la fusión del material genético de dos células especializadas para ello (gametas) en una sola (cigoto) a partir del cual se desarrolla el nuevo ser por divisiones sucesivas (generalmente mitóticas) y diferenciación celular. (Uribe, 1988).
2. OBJETIVOS
• Identificar morfológicamente las estructuras típicas de flores monocotiledóneas y dicotiledóneas.
• Reconocer anatómicamente los órganos masculinos y femeninos de flores monocotiledóneas y dicotiledóneas.
3. MARCO TEORICO
Beck, (2007), define La flor como el lugar donde se lleva a cabo la reproducción sexual en angiospermas. Las angiospermas, son actualmente las plantas mas abundantes de la tierra, con aproximadamente 235000 especies (Curtis and Sue, 1994). De todas las partes de las plantas en floración, la flor es la menos afectada por los cambios del ambiente. La forma de las hojas, se ve afectada por la edad, luz, el agua y la nutrición, pero no sucede lo mismo con la anatomía y morfología básica de las flores y de los frutos. Esta consistencia de las estructuras florales, hace que las flores y los frutos sean en orden a su clasificación las partes más importantes de las angiospermas. Las etapas esenciales de la reproducción sexual, la meiosis y la fecundación, se llevan a cabo en la flor (Weier et al, 1988).
Según Uribe, (1988), una flor característica esta formada por las siguientes estructuras: Pedúnculo, eje corto que une la flor con la rama y se ensancha en su extremo constituyendo el receptáculo o base floral. (Ver figura No 1.) Si se trata de una inflorescencia, la parte del pedúnculo en la cual se insertan las flores se llama raquis y el tallito que une a cada flor al raquis, recibe el nombre de pedicélo.
Una flor típica consta de cuatro verticilos (Fuller and Ritchie, (----); Weier et al, 1988; Uribe, 1988). Ellos son: sépalos, pétalos, estambres y pistilo. (De la Cruz, 2004) .Ver figura No 1.
Es distintivo de las plantas monocotiledóneas, presentar solo tres verticilos florales o múltiplos de éste, como la flor de lirio (Lilium sp) la cual presenta tres sépalos y tres pétalos, un pistilo con tres carpelos en el ovario y seis estambres (Uribe, 1988).
Para Beck, (2005) y De la Cruz, (2004), El conjunto de sépalos se denominan cáliz, y se encuentran en la parte basal de las partes florales, en muchos casos son verdes y realizan fotosíntesis. El conjunto de pétalos se denomina corola, la cual junto a el cáliz se denominan perianto.
Dentro de los pétalos se encuentran los estambres, que producen los granos de polen. El estambre consta generalmente de tallo o filamento, que lleva en su ápice un a sola antera. En la antera (Figura No 1 y 2) se desarrollan los granos de polen que mas adelante conducen a la formación de las células reproductivas masculinas o espermatofitos. (De la Cruz, 2004). Los estambres y los pistilos se consideran las partes esenciales de la flor, ya que son los responsables directos del proceso reproductivo. Los sépalos y los pétalos son partes accesorias, pues no intervienen directamente en la reproducción. Cundo la flor posee los cuatro verticilos es completa e incompleta si falta uno de ellos. (Beck, (2005); De la Cruz, (2004), Uribe, (1988)).
El pístilo se ubica en la parte central de una flor completa y consta de tres porciones visiblemente diferentes, a saber el ovario esta compuesto de uno o varios carpelos (la estructura reproductora femenina, (Sue and Curtís, 1994).), que son órganos portadores del óvulo; los pistilos pueden ser simples (un solo carpelo) o compuestos (varios carpelos); el estilo agrandado y alargado , que arranca de la parte superior del ovario y en el extremo del estilo esta el estigma en donde caen o son llevados los granos de polen antes de la fecundación de las semillas inmaduras u óvulos. (De la Cruz, 2004).Según el tipo de estructuras reproductoras que posean (sexo de la flor), estas pueden ser: Flor bisexual o hermafrodita, cuando tiene los estambres y pistilos o flor unisexual cuando posee solo uno de las dos estructuras esenciales. En cuanto al sexo de planta, o sea la condición sexual de las flores, las plantas se clasifican como: Monoicas(poseen estambres y pistilos en la misma flor , ejemplo el maíz),Dioicas(si los sexos están separados, esto es, las flores pistiladas están en una planta y las flores estaminadas en otra planta de la misma especie, ejemplo el sauce ) y un caso menos frecuente las polígamas(presentan tanto flores unisexuales como bisexuales, ya sea en la misma planta o en plantas distintas de la misma especie, como es el caso del papayo).(Uribe,1988)
Figura No 1. Estructura morfológica de la flor dicotiledónea (San Joaquín)
(W.Guerrero.Laboratorio de Biología, U. Nacional de Colombia, Sede Medellín)
Existen diversa clases de flores, son completas si tienen las partes ordinarias o los cuatro verticilos ósea; pétalos, sépalos, estambres y carpelos (pistilos); es incompleta cuando si falta un o varios verticilos. Se habla de una flor perfecta cuando esta lleva estambres y carpelos prescindiendo de si tiene o no sépalos y pétalos, en este caso se le denomina bisexual o hermafrodita; es imperfecta si solo lleva uno de los verticilos reproductores o fértiles, la cual puede ser estaminada o masculina si solo tiene estambres y postilada o femenina si solo tiene carpelos y se les denomina neutras.
Figura No 2. Morfología de la flor monotiledónea (Lilium sp)
(W.Guerrero, Laboratorio de Biología, U. Nacional de Colombia, Sede Medellín).
Figura No. 3. Corte transversal de anteras de la flor. A-Aumentada 100x B-.Aumentada 400x
(Laboratorio de Paleoecologia, U. Nacional de Colombia, Sede Medellín)
Cuando los pétalos son independientes entre si la corola es dialisépala; cuando se sueldan más o menos por sus bordes laterales la corola es gamopétala.
Corola dialipétala Corolas gamopétalas
Tomado de Universidad de León (España)
Las anteras hace parte del estambre y es sostenido por el filamento, la cual esta formada por dos sacos o bolsitas llamadas tecas, cada una de las cuales; posee generalmente dos cavidades o sacos polínicos en donde se forma el polen. Algunas de las partes de la antera se ven el en la figura No 3.
Las inflorescencias son ramas del tallo, con crecimiento limitado, portadoras de flores. Constan de un eje donde se insertan las flores, brácteas (Hipsófilos), que son hojas modificadas, y flores. Algunos de los tipos de inflorescencias son:
• racimosas: con el eje principal de crecimiento indefinido, alargado o corto, con ramificaciones laterales. En los racimos las flores son pediceladas y se insertan directamente en el eje de la inflorescencia; en las espigas las flores son sentadas. En las panículas se insertan en el eje de la inflorescencia racimos, de modo que se forma un racimo de racimos. En las umbelas todos los pedicelos se insertan en un mismo punto y se alargan de modo que el conjunto de las flores forma una superficie plana, cóncava o convexa; el corimbo es similar, pero con los pedicelos de las flores insertos a distintas alturas del eje de la inflorescencia. En el capítulo el pedúnculo se ensancha en su extremo dando lugar a un receptáculo, donde se insertan las flores. Ver figura No. 4
• cimosas: con el eje principal de crecimiento limitado, rematado en una flor, originándose las siguientes flores en ramas laterales. Son comunes las cimas escorpioideas, en las que hay una ramificación por nudo, bajo la flor terminal, y los dicasios, en los que se producen dos ramificaciones por nudo. Ver figura No. 5
Figura No. 4. Tipo de inflorescencias (racimosas).Tomadas Universidad de Navarra (España) Herbario
Figura No 5. Tipo de inflorescencia (cimosas). Tomadas de Universidad de Navarra (España) Herbario
4. MATERIALES
Estéreomicroscopios, Microscopios, Cuchillas de afeitar nuevas, agujas enmangadas, flores de monocotiledóneas (Lilium sp, Lirio, Pasto), Flores de dicotiledóneas (Hibiscus sp San Joaquín, Rosa, ), Polen.
5. PROCEDIMIENTO
Primera actividad: Morfología floral
• Observe y esquematice las partes de las flores monocotiledóneas y dicotiledóneas que se le proporcionen.
• Determine con base en la información suministrada en la guía, la complejidad de las flores: completa o incompleta y si es perfecta o imperfecta.
• Determine la clase de las flores suministradas(mono o dicotiledónea)
• Realice la clasificación de las inflorescencias que se le proporcionen.
Segunda actividad: Anatomía floral
• Observe y esquematice las partes de las anteras (micropreparados) que se le suministren.
• Realice un corte transversal de ovario con una cuchilla nueva e identifique sus partes en el microscopio.
• Haga un raspado de las anteras sobre una placa portaobjetos, agregue agua o colorante. Esquematice.
6. CUESTIONARIO DE CONSULTA
A-Esquematice y explique el ciclo de vida una angiosperma.
B- Cuantas clases de reproducción tienen las plantas?
C. Cuando se habla de plantas entomófilas, anemofilias, a que nos referimos?
D-El conjunto de estambres reciben el nombre de?
E-Los sacos o bolsa que contienen el polen se denominan?
F-Las células madre del polen se dividen por meiosis o mitosis. Son diploide so haploides .Cual es su significado? Explique brevemente.
G-El polen es una célula? Que función desempeña?
H-Que campos de la biología utilizan el polen como fuente de información? porque les es útil?
I-Que es un carpelo. Mencione los tipos de carpelos.
J-Que es la polinización?
K-Que tipos de polinización existen?
L-Cual de tipos de polinización es mas común?
M-Que es una inflorescencia?
N-Cual es la importancia económica de las flores?
Ñ-Que pigmentos predominan en las flores?
7. BIBLIOGRAFIA
BECK, CH. 2005. An Introduction to Plant Structure and Development. Cambridge, University Press.p316-349.
LUQUE, R.; RICO, R.; LEÓN, Y.; ESTRADA, J.________.Practicas de biología Vegetal. Universidad de los Andes, Facultad de Ciencias, Mérida Venezuela. Disponible en: www.udla.edu.ve consultado el 10 de septiembre, 2008.
ROLDAN, G.; VELÁSQUEZ, L.F; MACHADO, T.1984.Biología Integrada, los seres vivos y su ambiente. Editorial Norma, bogota Colombia. 253p.
VELÁSQUEZ, C., SANCHEZ, D. 2007. Guía para laboratorio de Botánica General. Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín, facultad de Ciencias; Departamento de Biología. Centro de Publicaciones.83p
URIBE, F.1988. Botánica General. Universidad de Antioquia. Editorial Universidad de Antioquia. 333p.
CURTIS, H.; SUE BARNES, N. 1994. Biología. Editorial medica Panamericana. 1199p.
DE LA CRUZ, A.; G.A. 2004. Morfología Vegetal. Universidad Nacional de Colombia. Departamento de Ciencias Básicas. Sede Palmira.96p
MAUSETH, J.D. 2003. Botany, an introduction to plant Biology. Third Edition. University of Texas, Austin. Jones and Bartlett Publishers, Sudbury, Massachusetts. 848p
Referencias electronicas
http://www.unavarra.es/servicio/herbario/htm/inflorescencia.htm
http://www3.unileon.es/personal/wwdbvmgg/practica9.htm
PRACTICA DE MITOSIS I
1. INTRODUCCIÓN
La continuidad de la vida depende de la reproducción. En el proceso, los padres producen una nueva generación de células o individuos multicelulares iguales a ellos. La división celular constituye un puente entre las generaciones (Starr and Taggart ,2004). Agregan los mismos autores, que si una célula se divide, cada uno de sus dos células hijas recibe el número necesario de moléculas de ADN y parte de citoplasma. En células eucariontes, el mecanismo de división llamado mitosis clasifica el ADN en los dos nuevos núcleos. Un mecanismo adicional divide el citoplasma.
En tal sentido expresa Mauseth (2003), como el ciclo celular involucra dos procesos a saber: el primero la división del núcleo llamado cariocinesis y la segunda la división del citoplasma denominada citocinesis. Adiciona el anterior autor, que existen dos tipos de cariocinesis: mitosis y meiosis.
Cuando la célula está en los estadios interfásicos del ciclo, los cromosomas son visibles dentro del núcleo sólo como delgadas hebras de material filamentoso llamado cromatina. (Curtis et al., 2003)
2. OBJETIVOS
• Determinar el índice mitótico de las células de raíz de cebolla.
• Reconocer y comprender las diferentes fases de la mitosis.
• Estudiar la mitosis en células somáticas de cebolla.
• Visualizar la Mitosis como mecanismo de crecimiento y reproducción asexual.
• Investigar sobre la importancia biológica de la mitosis.
3. MARCO TEORICO
Como ya se menciono, la mitosis es una división donde es la duplicación de los cromosomas o cariocinesis. Siendo este, una forma de crecimiento e incremento de células en eucariontes multicelulares (Mauseth, 2003; González et al, 2004, Starr and Taggart, 2004).
La mitosis tiene como objetivo conservar el mismo número de cromosomas característico de cada especie. Obteniéndose como resultado de la mitosis dos células diploides, cada una idéntica a la célula original y con cromosomas idénticos en estructura y función. (Roldan et al ,1984).
Algunas del as fases que trataremos de identificar son:
La interfase, donde las células están reposo, los cromosomas no son visibles y núcleos con apariencia granular.
La profase, los cromosomas son claramente visibles, y la membrana nuclear desaparece.
La metafase, los cromosomas se ubican en el ecuador celular aparece una estructura fibrilar llamada el huso, una zona particular de cada cromosoma llamada centrómero.
La anafase, las dos cromatidas unidas de cada cromosoma se separan, y se mueven hacia los polos de cada célula; así se pueden observar dos grupos idénticos de cromatidas en la célula.
La telofase, los cromosomas pierden su apariencia distintiva. En la placa ecuatorial de la célula empieza a aparecer la nueva pared celular que divide las dos células hijas; los núcleos de éstos empiezan a diferenciarse. Reaparece la membrana nuclear.
Las células hijas, simulan ser células en interfase con núcleo bien diferenciado y los cromosomas no visibles, excepto que son la mitad de tamaño normal y antes de la próxima división cada núcleo tiene que alcanzar el tamaño de la célula original (Jiménez, 1986). Ver figuras No 1 y 2.
Figura No 1. Fases de la mitosis. 100x (Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín .Escuela de Biociencias.2008)
Figura No 2. Fases de la mitosis. 100x (Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín .Escuela de Biociencias.2008)
4. MATERIALES
Microscopio, Pinzas de madera, meristemo apical de cebolla, Tubos de ensayo 10 ml.
Alcohol etílico, Papel de filtro, ácido acético, Mecheros, Acetocarmin, Pinzas cuchillas de afeitar nuevas portaobjetos y cubreobjetos
5. PROCEDIMIENTO
• Realice un montaje de una cebolla de huevo como aparece en la figura No. Con mínimo ocho (8) días de antelación.
Figura No. 3. Montaje de cebolla (Allium sp) para inducir el crecimiento de raíces.(Laboratorio de Biología, Escuela de Biociencias,Sede Medellín)
• Tres de los ocho días, deje el montaje de la cebolla en completa oscuridad y después retire de este estado.
• Una vez en el laboratorio, corte 3 o 4 mm del extremo inferior de algunas raicillas(a mayor cantidad de ellas mayor chance de observar fases)
• Si es necesario , descarte 1 mm de la raíz, que correspondiente a la cofia
• Los 2 o 3 mm restantes sumérjalos en un tubo de ensayo con carnoy (ácido acético y alcohol) en proporción 1:2 por varios minutos.
• Flamear las raíces junto a la solución por 2 minutos aproximadamente, evitando la ebullición violenta.
• Al cabo de este, retire los trozos de raíces y colóquelos en una lamina portaobjetos, agregándoles una o dos gotas de acetocarmin(colorante de origen vegetal)
• Macere firmemente, con la ayuda de una espátula por varios minutos
6. CUESTIONARIO DE CONSULTA
A-Cual es el papel biológico de la mitosis?
B-Porque se utiliza meristemo apical de raíz y no otro órgano de la planta?
C-Que papel cumple el carnoy en el protocolo realizado?
D- Que papel cumple el acetocarmin en el protocolo realizado?
E-En que fase de la mitosis hay síntesis y duplicación del ADN?
F-Las características presentes en las fases de la mitosis de células vegetales es igual a la células animales?
7. BIBLIOGRAFIA
STARR, C.; TAGGART, R.2004. Biología, La unidad y la división de la vida. Editorial Thomson. Décima edición.P150-161.
GONZALEZ, T., SPINEL, C.2004. Practica de laboratorio Biología Celular. Universidad Nacional de Colombia.Facultad de Ciencias.Sede Bogota .87p.
MAUSETH, J.D. 2003. Botany, an introduction to plant Biology. Third Edition. University of Texas, Austin. Jones and Bartlett Publishers, Sudbury, Massachusetts. 848p
CURTIS, H.; SUE BARNES, N. 1994. Biología. Editorial medica Panamericana. 1199p.
JIMENEZ, J.M. 1986. Manual de Practicas de Laboratorio de Biología General. Universidad de Costa Rica. Escuela de Biología.64p.
PRACTICA DISECCIÓN DE VERTEBRADOS
1. INTRODUCCIÓN
La descripción de un organismo, usualmente involucra su disección, por lo que en esta sesión se explorarán las técnicas de reconocimiento de estructuras morfológicas internas y órganos.
Una discusión que generalmente se presenta cuando se sacrifica o experimenta con un organismo para fines de estudio, es precisamente el valor de la vida y del propio organismo que se trabaja, por lo que se sugiere considere este tema dentro de la discusión de sus resultados.
Para la selección del organismo a disectar, restringiremos por razones prácticas a animales vertebrados, de tamaños mayores de 15 cm. Como ejemplo pueden ser un conejo, rata, pollo, rana, culebra o un pez.
Por otro lado, por ser de valor decorativo la piel o alimenticio la carne, en caso de que en el equipo de trabajo, se pretendan utilizar posteriormente los restos del organismo, se recomienda consultar previo a la disección los cuidados específicos que se deben tener.
2. OBJETIVOS
• Observación de la anatomía externa e interna de un vertebrado
• Reconocer al menos los siguientes órganos y sistemas de un organismo de laboratorio: Aparato digestivo, hígado, riñones, corazón, pulmones (o su equivalente), aparato reproductor, cerebro.
3. MARCO TEORICO
El animal tiene forma de huso comprimido. En él pueden diferenciarse tres regiones: cefálica, troncal y caudal.
• Región cefálica
En la cabeza se abre la boca en la parte anterior. Por encima de ella se abren los orificios nasales (narinas) y posteriormente se sitúan los ojos. La parte posterior está limitada por un opérculo que cubre las branquias.
• Región troncal
El tronco comienza inmediatamente detrás de la cabeza.
Todo el tronco recubierto de escamas imbricadas (cada una cubre la mitad de la siguiente) presentado la porción descubierta células pigmentarias. En la escama se observan estrías de crecimiento concéntricas. A ambos lados del cuerpo se observan líneas de escamas diferentes que constituyen un órgano sensorial conocido como línea lateral.
En el tronco se sitúan las siguientes aletas
un par de Aletas torácicas , un par de Aletas pélvicas y las Aletas dorsales .
• Región caudal
Comienza tras el orificio anal.
Está como la zona torácica cubierta de escamas y en ella se encuentra la aleta caudal y la aleta anal
Las aletas de los peces óseos pueden llevar radios espinosos simples, radios compuestos , o no tenerlos (aleta adiposa)
Anatomía interna
• Musculatura
Con unas tijeras de punta fina realizar una incisión en la zona caudal y separar la piel en una franja de unos 3 cm. de ancho para observar los paquetes musculares. Hacer lo mismo en la zona troncal.
Realizar una incisión con las tijeras por la línea medio ventral desde el orificio anal hasta el opérculo. Ascender seguidamente hacia el dorso bordeando el opérculo. Levantar el flanco y dejar al descubierto la cavidad visceral.
• Digestivo.
Observar el esófago musculoso, el estómago, los ciegos pilóricos, el hígado (de gran tamaño), la vesícula biliar situada bajo el hígado, el bazo unido al ángulo posterior del estómago (color rojizo)
Tras observarlo cortar a nivel del esófago extraerlo.
En la parte superior de la cavidad visceral se encuentra la vejiga natatoria llena de gas.
• Excretor
Tras la vejiga natatoria se encuentran los riñones alargados y de color oscuro.
• Reproductor
Las gónadas tanto en machos como en hembras son unas masas alargadas dispuestas longitudinalmente en la cavidad visceral. Desembocan junto al digestivo y el excretor.
• Circulatorio
El pericardio que contiene el corazón se encuentra en la parte anterior del animal bajo las branquias.
El corazón consta de una aurícula (masa blanda e irregular de color rojo oscuro) , un ventrículo muy musculoso de forma piramidal y el bulbo aórtico que posteriormente se bifurca hacia las branquias.
• Respiratorio
Abrir la cavidad branquial levantando el opérculo y estudiar los arcos branquiales. Extraer uno de ellos y observar las laminillas que forman las branquias así como los finos dientes de la cara interna (branquiespinas)
• Esqueleto
Para observar bien el esqueleto es necesario separarlo de la musculatura los que se consigue cociendo el animal. Por cuestiones de tiempo no se realizará esta separación, pero si se observará una vértebra y se seccionará el cráneo para extraer el encéfalo.
• Nervioso y órganos de los sentidos.
Extraer un ojo y observar su estructura
Seccionar el animal y observar el aspecto de la médula espinal.
• Intentar extraer el encéfalo y observar sus partes. Para ello cortar longitudinalmente con un bisturí con mucho cuidado el cráneo a la altura de los ojos y separar el hueso dejando visible el encéfalo.
4. MATERIALES
Bandejas de disección, caja petri, estuche de disección (pinzas, bisturí, pinzas -al menos de punta fina, punta roma y diente de ratón-, navajas de repuesto, gotero), cloroformo, organismo de laboratorio a disectar, guantes, tapabocas, algodón, lápices de colores.
5. PROCEDIMIENTO
• Con la ayuda del profesor sacrifique al organismo.
• En la región ventral, efectúe un corte a lo largo del cuerpo y otros cortes entre los apéndices anteriores (con excepción de aves) y entre los posteriores. Tenga cuidado de solo cortar la piel y músculo.
• Inicie la exploración de los diferentes órganos y sistemas.
• Para la visualización del cerebro, con las tijeras efectúe un corte de cráneo de la base de la cabeza a la base de los ojos y luego entre los ojos. Finalmente levante la tapa craneal.
• Esquematice y coloree, los órganos y sistemas que identifico.
6. CUESTIONARIO DE CONSULTA
A-¿Dónde se sitúan los dientes de la trucha?
B-¿Dónde se encuentra el ano? ¿Por qué no es terminal como en la mayoría de los invertebrados?
C-¿Comunican los orificios nasales con la boca? ¿Por qué?
D-¿Tiene oídos? ¿Por qué? Explica en qué consiste y cómo funciona la línea lateral de los peces
E-¿Qué tipo de aletas tiene la trucha? ¿De qué tipo es su aleta caudal?
F-¿Dónde acumulan la grasa? ¿Por qué no bajo la piel como los humanos?
G-¿Poseen órganos copuladores los machos? ¿Por qué?
H-Explicar la función del arco branquial, los filamentos branquiales y las braquiespinas.
I-Indicar las modificaciones que respecto a esta organización particular presentan otros vertebrados
J-Esquematice las estructuras internas de un insecto.
K- Esquematice un platelminto (como la planaria), mostrando sus estructuras internas.
L- Esquematice un árbol señalando los principales sistemas que posee.
M-Construya un cuadro comparativo de las órganos y sistemas de vertebrados, señalando definición, función y tipos de tejidos que lo componen.
N- Cuáles son las características que debe cubrir un organismo, para considerarlo de laboratorio. Que cuidados se deben tener en su manejo.
7. BIBLIOGRAFIA
GAVIRIA, A., DORDA, J. .Anatomía interna Básica: Disección de un pez. Disponible en www.AcuarioProfesional.com Consultado Noviembre 24 de 2008.
PRACTICA CONTEO CELULAR
1. INTRODUCCIÓN
El azul tripán (azul Diamina, azul Niagara, azul vital) es un colorante derivado de la toluidina que posee la capacidad de teñir a tejidos y células muertas (Ehrlich, 1904). Su nombre se deriva de su capacidad para matar a los Tripanosomas, parásitos causales la enfermedad de Chagas en América, Enfermedad del Sueño en África y Leishmaniasis. Este colorante es uno de varios empleados para evaluar la viabilidad de células por exclusión de captación, ya que no puede penetrar y teñir a las células vivas con membranas íntegras. El azul tripán no es necesario para realizar conteos simples de células pero sí es imprescindible para diferenciar entre las células muertas (con disrupción membranal) de las vivas con membranas íntegras.
2. OBJETIVO
• Establecer la densidad celular en suspensión.
• Determinar el porcentaje de células viables.
3. MARCO TEORICO
En este procedimiento, una suspensión de células mononucleares (CMN) es mezclada con una solución al 0.4% de azul tripán antes de ser observada bajo el microscopio haciendo uso de un hemacitómetro de Neubauer. A pesar de que el protocolo original estipulaba el uso de una mezcla isovolumétrica de azul tripán y suspensión celular (digamos, 10 μL de suspensión celular y 10 μL de azul tripán), también se puede hacer uso de otros tipos de diluciones (especialmente para suspensiones celulares muy concentradas), siempre y cuando se considere el factor de dilución correspondiente en los cálculos finales.
El hemacitómetro es un portaobjetos especializado en el cual una retícula es grabada con láser. Su construcción permite conocer el volumen de cualquier líquido colocado sobre el y por debajo de su cubreobjetos. La retícula se encuentra compuesta por nueve cuadros de 1 mm2 cada uno (cuadro azul en la figura inferior). Los cuatro cuadros de 1 mm2 localizados en cada esquina poseen a su vez 16 cuadros de 0.0625 mm2 . El cuadro central (también de 1 mm2) se encuentra compuesto por 25 cuadros de 0.04 mm2 (en verde). Estos cuadros a su vez se encuentran compuestos por cuadros menores de tan solo 0.0025 mm2 (en negro). Dada la profundidad de la cámara de tan solo 0.1 mm, cada una de estas unidades corresponde a volúmenes fijos conocidos, según se ilustra en la imagen inferior.
Unidad/ Superficie/ Volumen
Cuadro Azul 1 mm2 100 nl
Cuadro Rojo 0.0625 mm2 6.25 nl
Cuadro Verde 0.04 mm2 4 nl
Cuadro Negro 0.0025 mm2 0.25 nl
4. MATERIALES
1. 40 μL (10-90 μL) de solución de azul tripán al 0.4% (Sigma T-8154)
2. 10 μL de la suspensión celular.
3. Gabinete de Seguridad Biológica (Para manipular suspensiones celulares que serán propagadas en cultivo).
4. Micropipeta p10 y p100.
5. Microtubos de 0.2 μL (tubos de PCR) reciclados pero limpios.
6. Hemacitómetro y cubre portaobjetos.
7. Microscopio óptico (no es necesario que sea invertido ni de contraste de fase).
8. Papel higiénico (Kleenex™) y al menos una toalla de papel absorbente (Sanita™).
9. Piseta con agua destilada.
10. Piseta con Etanol al 70%.
5. PROCEDIMIENTO
1. Coloque el objetivo 10x o 25x en el trayecto óptico del microscopio.
2. Estime el volumen de la suspensión celular de la cual se toma la alícuota para evaluar.
3. Disponga 90 μL de azul tripán al 0.4% (NOTA: los volúmenes permisibles oscilan entre 10 y 90 μL, ver abajo en notas)
en un microtubo de PCR o un pocillo de una multiplaca.
4. Transfiera una alícuota de 10 μL de la suspensión celular (en medio de cultivo o PBS) con una micropipeta p10 al microtubo que contiene el azul tripán.
Figura No. 1 Hemacitómetro Figura No. 2. Retícula grabada
5. Homogeneizar la mezcla por pipeteo.
6. Tome 10 μL con una micropipeta p10 y permita el llenado de una de las dos cámaras del hemacitómetro por capilaridad. (Figura 1.)
7. Coloque el hemacitómetro en el microscopio y localice la retícula grabada. (Figura 2)
8. Cuente por separado a las CMN azules (muertas) y a las CMN birrefringentes o blancas (vivas) que sean observadas en cada uno de los cuatro cuadros de esquina (cuadros 4x4, figura 2A; uno de los cuales es ampliado en la figura 2B).
9. Las células localizadas en los márgenes externos de cada esquina (marcados en rojo) NO deberán ser incluidas en las cuentas.
10. La cuenta total de células para los cuatro cuadros 4x4 deberá encontrarse entre 100 y 200 células. De lo contrario será necesario ajustar la dilución (usualmente diluyendo más la suspensión celular; 1:5 o 1:10) para minimizar el error de lectura asociado a altas densidades celulares.
11. Calcule sus resultados:
Células por ml = Cuenta total de células vivas ÷ Número de cuadros 4x4 evaluados × factor de dilución × 10x104.
Células totales = Células por ml x volumen (en ml) total del cual fueron extraídas las células evaluadas.
Viabilidad celular (%) = (Número de células vivas totales) ÷ (Número de células Vivas + Número de células Muertas) × 100
Ejemplo:
Se tiene un cultivo celular de 3 ml. Se resuspenden las células del mismo y se toma una alícuota de 1ml, de la cual se
Procederá a realizar el conteo. Se toman 10 μL de esta suspensión y se le agrega 90 μL de azul tripán (Dilución 1:10). Se
Cuentan los cuatro cuadros de 4x4 obteniendo un número total de células vivas de 455 con un total de 35 células muertas.
Células por ml = (455/4) × 10 × 10x104 = 11'375,000
Células totales = 11'375,000 × 3 = 34'125,000
Viabilidad = 455 ÷ 490 × 100 = 92.8 %
Notas:
1. El azul tripán tiene una mayor afinidad por las proteínas séricas que por las proteínas intracelulares. Si el fondo extracelular de la suspensión celular aparece oscuro será necesario volver a centrifugar la suspensión celular y resuspender el pellet celular en medio libre de proteínas, PBS o Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS).
2. Las células mezcladas con azul tripán deberán ser evaluadas inmediatamente. Incluso las células vivas captarán el colorante tras exposiciones superiores a los 5 minutos.
3. Si más del 10% de las células se encuentran formando cúmulos o agregados, repítase el procedimiento asegurándose de mezclar bien la suspensión celular y el azul tripán por micropipeteo repetido.
4. Por lo general una dilución 1:10 de suspensión celular: azul tripán suele bastar para permitir conteos exactos de muestras sanguíneas humanas (equivalente a 10 μL de suspensión celular + 90 μL de azul tripán).
5. El campo visual a 100x (Ocular 10x y Objetivo 10x) equivale cercanamente al recuadro central de 5x5 y por ende a un poco más de 1 mm2. (Figura 3.)
6. La cámara hemocitométrica deberá ser lavada con agua destilada al término de su uso empleando papel higiénico Kleenex™. ¡Las Sanitas™ no deberán ser empleadas para limpiar la cámara del hemacitómetro. Una vez lavado con agua se deberá enjuagar con Etanol al 70% y secarse con Sanitas™ (exterior de la cámara) y Kleenex™.
7. Al realizar conteos de cultivos celulares, generalmente es necesaria una dilución menor de la suspensión celular; (1:1 = suspensión celular: azul tripán) para tener una densidad celular adecuada.
7. BIBLIOGRAFIA
BARRIGA, M.M. 2008. Protocolos y métodos de conteo y evaluación de la viabilidad de células mononucleares.
REINA ET .2005 .Técnicas de contaje celular. Universidad de Barcelona. Departamento de Biología Celular.Disponible en: http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/contajecelular.htm, Consultado Octubre 20 del 2008.
PRACTICA PURIFICACION DE ESPERMATOZOIDES BOVINOS POR GRADIENTES
1. INTRODUCCIÓN
La preparación del esperma congelado para su utilización en programas de fertilización asistida, tanto en la especie humana como en animales domésticos, lleva consigo algún tipo de protocolo inicial con el objetivo de separar los espermatozoides vivos del propio plasma seminal, crioconservantes, e incluso de los espermatozoides muertos (Parrish,1991 ), En la especie humana, en donde puede existir un escaso número de espermatozoides móviles e incluso un elevado número de espermatozoides anormales, los procedimientos de selección de espermatozoides con una morfología óptima pueden ser de vital importancia.
Entre los sistemas más habituales para la preparación de esperma congelado de bovino usado en programas de fecundación in Vitro, destacan los siguientes: método de lavado por centrifugación, denominado también washing (Parrish et al., 1986), gradiente de densidad con Percoll (Saeki et al., 1990 y De los Reyes et al., 1996), filtración mediante columna de fibra de vidrio (Stabbings y Wosik, 1991), y el método de migración/sedimentación (___, 1996).
2. OBJETIVOS
• Determinar la viabilidad de espermatozoides bovinos mediante el método de gradientes por densidad.
3. MARCO TEORICO
La técnica de selección espermática más ampliamente utilizada es la del lavado por centrifugación. Sin embargo, en los últimos años se está utilizando cada vez más el método del gradiente de densidad con Percoll*, debido probablemente al elevado porcentaje de espermatozoides móviles, viables y con morfología normal que pueden ser recuperados (De los Reyes et ai., 1996).
Cada uno de los dos métodos de separación de esperma ofrece ventajas comparativas en el porcentaje de ovocitos, pero la utilización del gradiente de densidad de Percoll {61,7 %), es muy superior estadísticamente (p<0.001) que el método tradicional mediante lavado (40,2 %). Sin embargo, no existen diferencias significativas para los grupos de ovocitos polispérm feos y degenerados en uno u otro método. Del mismo modo, los índices de división obtenidos usando el método de gradiente de densidad con Percoll (65 %), son significativamente superiores (p< 0.001) a los conseguidos por el método de lavado (44,8 %).
Uno de los inconvenientes fundamentales de la utilización de semen congelado en técnicas de fecundación in vitro es la reducida viabilidad de los espermatozoides, debido al efecto directo del proceso de congelación/descongelación sobre la membrana plasmática del espermatozoide (Watson et a. 1992). Este daño del esperma puede verse incrementado durante la centrifugación y lavado a que es sometido el esperma durante su selección (Sánchez et al, 1995). Por este mismo motivo, en los últimos años se están utilizando, cada vez más, técnicas alternativas de selección de esperma congelado para su utilización en programas de fecundación in vitro. Uno de los métodos mas usados es el de gradiente con
Percoll. El Percoll es un medio de gradiente de densidad que puede ser utilizado para numerosas aplicaciones, tales como: purificación de células, virus e incluso orgánulos. La utilización de sistemas de gradientes de densidad discontinuos de Percoll, con el objetivo de la selección de espermatozoides móviles e inmóviles, esta siendo ampliamente adaptado en programas de fecundación in vitro en la especie humana, vacuno e incluso en otras especies de animales domésticos (Bollendorf et al., 1994; De los Reyes ét al., 1996). La utilización de este medio de gradiente de densidad permite aislar hasta un 90 p.100 de los espermatozoides móviles, la eliminación de los residuos tóxicos de crioconservantes y de los espermatozoides muertos, así como de obtener un elevado porcentaje de espermatozoides con morfología normal y acrosomas íntegros.
En conclusión, la utilización del sistema de gradiente de densidad con Percoll en la selección de esperma congelado de bovino para su uso en técnicas de fecundación in vitro, permite incrementar el índice de recogida de espermatozoides vivos por muestra, lo cual favorece la posibilidad de incrementar el número de ovocitos fecundados y por tanto de obtener un mayor número de embriones.
4. MATERIALES
• Placa X ,HPES – TALP (precalentado), IFV – TALP (precalentado y equilibrado en CO2,Sp – TALP (precalentado) ,Percoll (gradiente precalentado)
• Microscopio de disección , Cámara Flujo laminar
• Percoll 90% ,IVF – TALP ,Hepes – TALP ,Sp – TALP ,Sp – TL ,Tubos cónicos de centrifuga 7 X 15 ml
• Tres contenedores de centrifuga
• Placas de 4 well nunclon/para fertilizar
• Unidad descongeladora para pajillas de semen (termo)
• PHE ,Pipeteador de 1000 microlitros y pipetas (puntas)
• Pipetas estériles (1 X 5 ml y 1 X 2 ml) ,Pipetas plásticas Pasteur ,Microscopio ,Hemacitómetro ,Placa de Petri 60 x 15
• Soporte para tubos (colocado frente al calentador para evitar el shock térmico)
• Calentador expulsor de aire ,Tijerillas punta corta las pajillas (impregnadas de alcohol)
• Embolo para expeler el semen (impregnado de alcohol)
• Microscopio de lámpara para evaluar el semen ,Pipetas plásticas Pasteur (estériles) ,Pipeteador 25 micro litros
• Puntas para Pipeteador ,Manipulador de ovocitos (drummond o jeringuilla) ,Laminilla Térmica 38.5 0 C .
• Alcohol
5. PROCEDIMIENTO
Nota:
Es crítico que los espermatozoides no se expongan al shock de frió, un espacio caliente frente al área (calentón) donde se va a trabajar es necesario, tener precaución de que la temperatura no sea tan alta que quema las células espermáticas, los medios necesarios para el procesamiento del semen, deberán estar 2 horas antes en la estufa a 38.50 C, (IVF – TALP, HEPES – TALP, Sp – TALP, Percoll 90% y 45% < si se mezcla el Percoll antes de creando el gradiente, no deberán de pasar más de tres horas en ser usado>) el IVF- TALP deberá ser colocado en la incubadora a 38.50 C y 5% de CO2, colocándole la tapa encima sin apretar.
1.- Las pajillas de semen serán sacadas del termo de nitrógeno y descongelarse 45 – 60 segundos. El procedimiento es similar al utilizado para inseminación artificial, (se puede suplir el termo de descongelar por un vaso volumétrico con agua a 370 C) en prácticas de laboratorio usualmente se utilizan 3 dosis (pajillas) de semen de diferentes toros, una pajilla provee semen para 4 well (100 a 120 CCOs) el utilizar de tres toros diferentes garantiza la viabilidad del semen para cada well. Transferencia de las pajillas de semen del termo de nitrógeno líquido al termo de descongelamiento.
2.- Limpie las pajillas perfectamente (secar) con una toalla de papel y con las tijeras (previamente inmersas en alcohol al igual que el embolo expulsor del semen y sacados al aire) cortar las puntas de las pajillas, para con el embolo posteriormente expeler su contenido en el gradiente de Percoll (figura 15), teniendo precaución de no enturbiar el gradiente y que el semen no pase la línea del 45%. Nota: Una forma fácil y segura es poner las pajillas dentro del tubo del Percoll y con el embolo expeler hasta que llegue al borde del gradiente el tapón de algodón.
Colocación del esperma en el Percoll, antes se corta con las tijeras la punta de las pajillas. El contenido de las pajillas es expelido dentro del tubo conteniendo el gradiente de Percoll utilizando el embolo.
3.- Ponga el tubo cónico conteniendo el semen en la centrifuga dentro del contenedor previamente calentado a 38.50 C en la estufa, y centrifugar a 1000xg X 10 minutos (2.5 X 10 minutos).
4.- Después de centrifugar, colectar el pellet de semen (con pipeta Pasteur estéril) del fondo del tubo cónico.
No enturbiar el medio y sin tomar de el por qué el Percoll es toxico para el semen. Remoción del pellet de esperma, del tubo con el gradiente de Percoll.
5.- Coloque el pellet de esperma en el tubo cónico de 15 ml que contiene los 10 ml de HEPES – TALP, introducirlo en otro contenedor de centrifuga precalentado, y posteriormente centrifugar a 200xg X 5 minutos (1.5 X 5 minutos), es importante que se haga en el tiempo y velocidades descrito.
6.- Remover el sobrenadante con una pipeta Pasteur esterilizada, dejando únicamente el pellet de semen en el tubo. Tener mucho cuidado, si se enturbia el medio se deberá centrifugar nuevamente.
Centrifugar el esperma con HEPES – TALP, la foto izquierda, muestra el esperma a punto de ser procesado, a la derecha el pellet de semen en el tubo después de ser aspirado el sobrenadante.
Figuras No. 1. Tubos con semen y Percoll
7.- determinar la dilución requerida, para lograr una concentración de 26 x 106 ml (esto produce la concentración final de esperma en la fertilización gotas de 1 x 106 ml).
El método para determinar la dilución será añadir 10 microlitros de esperma a 90 microlitros de agua para hacer una suspensión, de esta tomar 10 microlitros, y dicha muestra se colocara en el hemacitómetro para hacer el conteo de espermas en 5 cuadros y multiplique el numero resultante x 500 000/26 x 106 – volumen del pellet, para determinar la concentración x microlitro, diluya el esperma usando IVF – TALP, pre equilibrado a 38.5 0C y 5% CO2. Alternativamente añadir de 0.5 a 1 ml de IVF pre equilibrado al pellet de semen (cuanto más grande sea el pellet de semen mas la cantidad de IVF – TALP que se agregara). Con práctica se hace posible lograr la concentración de 26X106
El Hemacitómetro usado para contar células espermáticas, se gira de Izq. a derecha, y del centro a la derecha con la muestra de células espermáticas en el microscopio. El número total de células espermáticas en 5 de los cuadros multiplicado x 500 000/26 x 106 – volumen pellet determina la concentración por ml.
6. CUESTIONARIO DE CONSULTA
A. Investiga sobre otros métodos de selección espermática conocidos y menciona sus ventajas y desventajas.
B. Cual de los métodos conocidos ofrece mayor viabilidad de ovocitos en la fertilización in vitro. Explique.
7. BIBLIOGRAFIA
OCAÑA QUERO, J.M., M. MORENO MILIEN1, M. PINEDO MERLIN, M.A. ORTEGA MARISCAL Y A. RODERO FRANGANILLO._____. Efecto del método de selección de esperma congelado de bovino sobre los índices de fecundación y División in vitro. Universidad de Córdoba, España. Disponible en http://www.uco.es/organiza/servicios/publica/az/php/img/web/16_13_23_174_06.pdf. Consultado Enero 20 de 2009.
AVERY B, AND T. GREVE. 1995. Impacto Percoll on bovine spermatozoa used for; vitra insemination. Theriogenoiogy, 44:871 -878.
BOLLENDORF, A., J.H. CHECK, D. KATSOFF AND D. LURIE.1994. Comparison of direct swim-up, mini-Percoll, and sephadex g 10 separation procedures. Arch. Andro!., 32:157-162.
DE LEEUW, F.E., A.M. DE LEEUW, J.H.G, DEN DAAS, B.COLENBRANDER AND AJ.VERKLEIJ. 1993. Effects Of various cryoprotective agents and membrane Stabilizing Compounds on bull sperm membrane integrity after coolingandfreezing. Cryobiology, 30:32-44.
DE LOS REYES, M, C. ALMENDRA, M. BERLAND, H. DEL CAMPO AND C., BARROS.1996. Selection offrozen bull spermatozoa form vitro fertilization. Archivos de Medicina Veterinaria, 28:31-38.
PRACTICA PERMEABILIDAD CELULAR
1. INTRODUCCIÓN
La célula como organismo vivo requiere establecer continuo contacto con el medio exterior que la rodea, o bien eliminando las sustancias de desecho; o permitiendo el ingreso de otras a través de las membranas. El movimiento de moléculas disueltas en los fluidos y de agua ocurre tanto por transporte pasivo como por el que requiere energía.
La osmosis, como mecanismo de transporte por las membranas, permite la difusión del agua a través de una membrana con permeabilidad diferencial, esto es, una membrana que es más permeable al agua que a los solutos disueltos (Audesirk and Audesirk, 1996).
La difusión es el movimiento neto de moléculas desde un gradiente de alta concentración a otro de baja concentración (Audesirk and Audesirk, (1996), Salomón, et al 2007).
2. OBJETIVOS
• Observar el efecto de la concentración del medio sobre las células vegetales y animales.
• Examinar algunos fenómenos de difusión de moléculas dentro de un fluido.
3. MARCO TEORICO
Como bien lo señala Audesirk and Audesirk (1996), la osmosis no es mas que la difusión de agua por la membrana; explica los mismos autores que, el agua, al igual que cualquier otra molécula, se mueve mediante difusión de regiones de alta concentración de agua a las de baja concentración (González y Spinel, 2004).
Para Salomón, et al (2007) las células deben conservar un ambiente interno adecuado a fin de llevar a cabo las muchas reacciones químicas necesaria par sostener la vida. La membrana plasmática que rodea a todas a las células las separa físicamente del ambiente externo y las define como entidad separada, además de ayudar a mantener un ambiente interno favorable para la vida al regular el paso de materiales hacia adentro y afuera de la célula (Starr and Taggart, 2007).
Que una membrana permita o no el paso de una sustancia a través de ella depende del tamaño y la carga de la sustancia y de la composición de la membrana. Se habla de una membrana permeable cuando esta permite que la cruce, e impermeable en caso contrario. Una membrana es semipermeable si solo permite el paso de algunas sustancias. En general las membranas son más permeables a las moléculas pequeñas y sustancias liposolubles capaces de cruzar el interior hidrófobo de la bicapa (Solomon, et al 2007). Sostiene el mismo autor, que en respuesta a las condiciones ambientales o necesidades celulares cambiantes, una membrana plasmática puede constituirse en barrera para una sustancia dada en un momento y promover de modo activo su paso en otro instante.
Las membranas biológicas que rodean a células, núcleos, vacuolas, mitocondrias, cloroplastos y otros organelos subcelulares son semipermeables a diferentes tipos de moléculas.
El transporte por las membranas puede ocurrir a través del transporte pasivo, el cual corresponde al movimiento de sustancias por una membrana, que va hacia un gradiente de concentración, presión o carga eléctrica y no requiere energía por parte de la célula. En este primer mecanismo se identifican la difusión simple, la consiste en el paso de agua, gases disueltos o moléculas liposolubles a través de la membrana bilipìdica de una membrana. El segundo mecanismo es la difusión facilitada, consistente en la difusión de moléculas generalmente solubles en agua por la membrana con participación de proteínas de membrana. El tercer mecanismo es el paso de agua de una membrana con permeabilidad diferencial (Audesirk and Audesirk, 1996).
El transporte que requiere energía involucra tres mecanismos a saber, el transporte activo, la endocitosis, y la exocitosis (Audesirk and Audesirk, 1996).
Como lo describe González y Spinel (2004) y Starr and Taggart (2007), el término isotónico indica dos o más soluciones que tienen igual número de partículas disueltas por unidad de volumen y por tanto poseen el mismo potencial hídrico y presión osmótica. No hay movimiento neto de agua a través de una membrana que separa dos soluciones isotónicas, a menos que se ejerza presión en uno de sus lados. Adicionan, los mismos autores que cuando se comparan soluciones de distinta concentración, la solución que tiene menor soluto (potencial hídrico mayor) se conoce como hipotónica y cuyo fenómeno se llama turgencia (Aristizabal, 2004) y la que posee mas soluto se conoce como hipertónica y cuyo fenómeno se denomina plasmolisis (Aristizabal, 2004). En la osmosis, las moléculas de agua se difunden de una solución hipotónica hacia una solución hipertónica a través de una membrana selectivamente permeable. Ver los tipos de medios en células sanguíneas y vegetales en las figuras No 1 y 2
Figura No 1. Modo en que las células vivas (sanguíneas) reaccionan a diferencias de presión osmótica.
Figura No 2. Modo en que las células vivas (Tradescantia) reaccionan a diferencias de presión osmótica.
4. MATERIALES
Hojas de Tradescantia, Soluciones Hipotónica, isotónica hipertónicas, laminas portaobjetos y cubreobjetos, Goteros, Beakers y tubos falcon, Gradillas, Jeringas hipodérmicas, alcohol antiséptico.
5. PROCEDIMIENTO
Primera actividad: Determinación del tipo de solución y fenómeno presenta en células de tradescantia.
• Desprenda con el dedo una porción de epidermis de hojas de tradescantia y llévela al portaobjetos.
• Agréguele al trozo de epidermis una de las soluciones preparadas con antelación y marcadas como A,B y C, las cuales corresponden a los tres tipos de medios iso,hipo y hipertónico; pero desconocidos para usted.
• Colóquele el cubreobjetos y realice los esquemas en todos aumentos (100x, 400x) y anotaciones respectivas.
• Repita los mismos pasos para las soluciones restantes.
• Por ningún motivo mezcle los goteros utilizados en cada solución.
• Incluya en sus anotaciones el tipo de medio a que corresponde y el fenómeno que se presenta
Segunda actividad: Determinación del tipo de solución y fenómeno presente en células sanguíneas.
• Utilice los implementos de seguridad (guantes de látex).
• Realice la desinfección respectiva del área donde se tomara la muestra de sangre con alcohol antiséptico y algodón.
• Tome una lanceta estéril y haga una punción en el dedo del donante.
• Deposite una gota de sangre por cada lámina portaobjetos.
• Agréguele a gota de sangre una de las soluciones preparadas con antelación y marcadas como A,B y C, las cuales corresponden a los tres tipos de medios iso,hipo y hipertónico; pero desconocidos para usted.
• Colóquele el cubreobjetos y realice los esquemas en todos aumentos (100x, 400x) y anotaciones respectivas.
• Repita los mismos pasos para las soluciones restantes.
• Por ningún motivo mezcle los goteros utilizados en cada solución.
• Incluya en sus anotaciones el tipo de medio a que corresponde y el fenómeno que se presenta
• Finalizada la práctica, deposite en el recipiente de riesgo biológico las laminillas utilizadas con sangre.
6. CUESTIONARIO DE CONSULTA
A-Escriba los principales principios de la osmosis.
B-Cual es el papel de la ósmosis en la vida de la célula?
C-Que es el potencial osmotico? En que se diferencia de la presión hidrostática.
D-La presión que ejerce una solución sobre una membrana o pared influye en?. Desplazamiento osmotico del agua? Explique.
E- Explique porque las heladas afectan los cultivos.
F-Indique algunos procesos biológicos en plantas y animales relacionados con la osmosis.
G-¿En que consiste el electro diálisis?
H-De un ejemplo de una aplicación práctica del principio de la diálisis en el campo de la salud.
I-Consulte cómo se realiza en que consiste un osmómetro.
J-En que consiste el modelo de mosaico fluido?
K-En que consiste la endocitosis y la exocitosis?
L-Cuales son las principales características del transporte activo? Cuales son las principales características del transporte pasivo? Que otro nombre recibe?
M-Se sabe que la fuerza que dirige la difusión son los gradientes de potencial químico o hídrico.¿En el continuo suelo-planta-aire son producidos por cuales factores?
N-Que efecto tiene la temperatura en la difusión? Están relacionadas proporcionalmente una con otra? Explique
Ñ-Explique como ocurre las relaciones hídricas en la célula.
7. BIBLIOGRAFIA
AUDESIRK, T.; AUDESIRK, G. 1996. Biología, La vida en la tierra. Prentice-Hall Hispanoamericana-. México.947p
GONZALEZ, T., SPINEL, C.2004. Practicas de laboratorio: Biología Celular. Notas de clase. Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogota. Facultad de Ciencias.87p
ARISTIZABAL, L.M. 2004. Fisiología Vegetal .Universidad de Caldas, Colombia.306p.
STARR, C.; TAGGART, R. 2004.Biología. La unidad y diversidad de la vida. Décima edición Editorial Thomson. 933p.
SOLOMON, E.P.; BERG, L.R.; MARTIN, D.W. 2001. Biología .Quinta Edición. Mc Graw –Hill Interamericana. 1237p.
PRACTICA DE FOTOSINTESIS
1-INTRODUCCIÓN
La fotosíntesis consiste en la conversión de energía luminosa a energía química, la síntesis de compuestos orgánicos a partir de dióxido de carbono y agua en presencia de clorofila, utilizando energía lumínica (Niemeyer, 1978; Azcon et al 1994, Audesirk and Audesirk, 1996, Aristizabal, 2003).
La fotosíntesis ocurre en dos etapas, la primera las reacciones que capturan energía y cuyo requerimiento es la luz en los tilacoides, esta luz incide en el fotosistemas II, lanzando electrones a un estado mas alto siendo reemplazados por moléculas agua, que liberan oxigeno estos electrones luego pasan a otro nivel bajo de energía llamado Fotosistema I, formando ATP, en este incide la luz lanzando los electrones hacia un aceptor de electrones, desde el cual pasan a NADP+ para formar NADPH. Estos electrones luego son reemplazados en el fotosistema I, por electrones del fotosistema II.
La segunda etapa, corresponde a las reacciones de fijación del carbono; no requieren luz y se realiza en el estroma. El NADPH y el ATP producidos en la s reacciones de captura de energía, son utilizadas para reducir el dióxido de carbono a carbono orgánico por medio del ciclo de Calvin, produciendo gliceraldehido fosfato, a partir del cual puede formarse glucosa y otros compuestos orgánicos (Curtis and Sue, 1993).
2. OBJETIVOS
• Establecer la influencia de factores como la concentración de CO2, la luz, en la producción de oxigeno
• Determinar el volumen (ml) de oxigeno producido por la planta Elodea versus tiempo.
3. MARCO TEORICO
Manifiesta Karp, (2005), como para que la energía lumínica pueda ser utilizada por los sistemas vivos, primero debe ser absorbida. La energía solar experimenta grandes cambios en su composición electromagnética y sus longitudes de onda son desde los 300 nm de la luz ultravioleta hasta los 2600 nm de la luz infrarroja (Meyer et al, 1973; citado por Aristizabal, 2004). Agrega el mismo autor que en la superficie terrestre, las longitudes de onda visibles representan el 50% del total de la radiación incidente en la parte superior de la atmósfera.
Figura No. 1 .Representación esquemática del espectro electromagnético de la radiación solar. La radiación fotosintética activa se ubica en el rango de 400 a 700 nanómetros (nm) .Tomado de http://www.unizar.es/departamentos/bioquimica_biologia/.
Los cloroplastos como unidad fotosintética esta rodeado por un a membrana, en cuyo interior se encuentra un material amorfo, gelatinoso y rico en las enzimas responsables en la fijación del CO2 y su conversión en carbohidratos, denominado estroma. En este se hallándolos tilacoides que contienen pigmentos fotosintéticos, y en los cuales se absorbe y utiliza la emergía lumínica para la fotólisis del agua y la formación de ATP, NADPH y O2 (Salisbury and Ross, 1994, Zelith, 1971; Bidwell, 1979; citados por Aristizabal, 2004). Ver figura No 2.
Figura No 2. Estructura anatómica del cloroplasto (Tomado de http://professores.unisanta.br/maramagenta/Imagens/ANATOMIA/cloroplasto.jpg&im
En ciertas partes del cloroplasto se ubican pilas de tilacoides denominadas granas. La lamela corresponde a la estructura de tilacoides que es el sitio del sistema fotoquímico de la fotosíntesis (Menke, 1962; citado por Aristizabal ,2004). Como la lamela tienen lugar las reacciones fotoquímicas de fotólisis del agua y en el estroma las reacciones termoquímicas de fijación y reducción del CO2 a carbohidratos, el cloroplasto ser considerado la unidad básica fotosintética mente activa (Aristizabal, 2004).
La clorofila, el pigmento que hace que las hojas sean verdes, absorbe luz en las longitudes de onda violeta y azul, rojo (Curtis and Sue, 1993); en tanto refleja las longitudes de onda verdes intermedias hacia los ojos que las ven.
Un pigmento es cualquier sustancia que absorbe luz, como las clorofilas son los principales pigmentos fotosintéticos absorbentes de luz, las plantas terrestres también contienen pigmentos accesorios naranja y rojo llamados carotenoides. Estos actúan como recolectores secundarios de luz, durante la fotosíntesis y extraen el exceso de energía de las moléculas excitadas de clorofila y la disipan como calor. Como la luz incide sobre la hoja esta compuesta por varias longitudes de onda, la presencia de pigmentos con distintas propiedades de absorción asegura un mayor número de fotones incidentes estimulen la fotosíntesis. Adiciona el autor, como esto puede verse si se examina un espectro de acción, que es una grafica de la velocidad relativa o eficiencia de la fotosíntesis producida por la luz de varias longitudes de onda (Karp ,2005).
Una hoja obtiene CO2 para la fotosíntesis a partir del aire , poros ajustables en la epidermis , llamados estomas se abren y cierran en el momento adecuado para admitir al CO2.. En el interior de la hoja hay unos capas de células que, en conjunto, reciben el nombre de mesófilo (contienen el mayor numero de cloroplastos), en consecuencia la fotosíntesis sucede principalmente en esas células (Audesirk and Audesirk, 1996).
Figura No. 3. El mecanismo de la fotosíntesis.(Tomada de http://mannover.files.wordpress.com/2008/07/fotosintesis.jpg&imgrefurl
Desde el punto de vista de la fijación del carbono, las plantas pueden agruparse en varias categorías así: Plantas C3, C4, CAM.
Las reacciones fotosintéticas no lumínicas para la fijación de CO2 en plantas C3, se conoce como ciclo de Calvin –Benson, o ciclo reductivo de la pentosa fosfato. El cual se lleva a cabo en tres partes principales: (1) Carboxilacion, que es la fijación de la molécula de CO2, (2) reducción, que es la formación de gliceraldehido fosfato para la producción de azucares y (3) regeneración, que es la recuperación de las moléculas aceptoras de CO2 y electrones, ribulosa 1,5 bifosfato y NADP+, respectivamente (Aristizabal, 2004).
La fijación del carbono por la vía C4, el CO2 se une al fosfoenolpiruvato (PEP) por acción de la enzima PEP carboxilasa. El ácido oxalacetico resultante se convierte en ácido málico o en ácido aspartico. En esta vía se fija primero en las células del mesofilo como ácido oxalacetico, luego es transportado a las células de la vaina fascicular, donde se libera bióxido de carbono y este ingresa al ciclo de Calvin, el ácido pirúvico regresa a la célula del mesofilo donde es fosforilado a PEP.
La tasa de fotosíntesis se puede estimar al cuantificar la cantidad de sustrato utilizado o de alguno de los productos obtenidos, indicados en la ecuación general de la fotosíntesis:
Energía lumínica
12H2O + 6CO2 6O2 + C6H12O6 + 6H2O
En plantas acuáticas es fácil apreciar las burbujas de oxígeno producido y medir su volumen. Para estudiar el efecto de un determinado factor sobre la actividad fotosintética, por ejemplo la intensidad lumínica, se aplican diferentes tratamientos variando la intensidad lumínica dejando los demás factores constantes (To, concentración de oxígeno). En el caso de la intensidad lumínica (I), varía en forma inversamente proporcional al cuadrado de la distancia.
Al graficar la cantidad de gas producido I/d2 se obtiene una línea recta hasta cuando I esta limitando la reacción. Si hay incremento de fotosíntesis a mayores intensidades, posiblemente otro factor, como la concentración de CO2 ó la To están limitando el proceso (González y Spinel, 2004).
La ecuación anterior nos sugiere que se puede medir experimentalmente la velocidad de la fotosíntesis en una planta, midiendo la velocidad con que la planta produce oxigeno. Puesto que el oxigeno apenas es soluble en agua, la producción de este gas por una planta acuática como elodea es bien evidente porque el oxigeno sube a la superficie del agua en forma de burbujas. La tasa de producción de burbujas será entonces un índice cuantitativo que nos permite investigar los efectos que pueden producir sobre la fotosíntesis algunos factores como la intensidad y la longitud de onda (color) de la luz (Jiménez, 1986)
4. MATERIALES
• Lámpara fluorescente(1), Tubos graduados, Beaker
• Beakers (4) de 1000ml, Embudos(4), Ramas de Elodea
• Na2HCO3 (bicarbonato de sodio en soluciones al 1, 2, 4%) , Regla milimetrada, Agua destilada, Timer.
5. PROCEDIMIENTO
Prepare soluciones del 0,5; 1, 2, y 4% de bicarbonato de sodio, un volumen por cada solución de 1lt. La cuarta solución será solo de agua destilada, y será el control. Tome cada uno de los Beaker e introduzca en ellos, un embudo invertido con varias ramas de Elodea, procurando que la cantidad de la planta sea la misma en todos los recipientes (Figura No 4).
Figura No. 4. Montaje para medición del volumen de oxigeno en planta Elodea.
Luego, vierta las soluciones en cada Beaker, evitando los derrames; tome cada tubo falcon graduado. Llene el tubo de la solución que corresponda e insértelo en el extremo del embudo, evitando que se formen burbujas en le mismo. Después de realizar el montaje, como aparece en la figura No 5.
Una vez hecho el montaje colóquelo a la distancia determinada de la fuente de luz (10 cm. o 20 cm.), encienda el bombillo y permita que transcurran de cinco a diez minutos con el objeto de estabilizar el sistema. Cuando la producción de gas sea uniforme, marque el nivel de la solución en el tubo aforado, este se registrara como el volumen inicial, en el t=0. A continuación registre cada 15 minutos el volumen de gas producido. Realice mínimo 5 lecturas.
Figura No 5 .Montaje para medición del oxigeno producido por la planta Elodea
Efecto de la concentración de CO2
Para determinar el efecto de la concentración de CO2, se considerará solo el montaje a la distancia de 20 cm de la fuente de luz. Para este objetivo, tabule los datos correspondientes a la concentración de NaHCO3 utilizada por su grupo y los demás resultados consignados en el tablero. Elabore una gráfica del rendimiento fotosintético en función de la concentración de CO2.
¿En este caso cual es la variable dependiente y cual la independiente?
• Elabore una gráfica del volumen de O2 en función del tiempo.
• Haga una gráfica del rendimiento fotosintético contra el cambio de temperatura y pH a concentración constante de CO2.
Registre los datos obtenidos en la siguiente tabla.
Tabla 1. Efecto de la concentración de CO2 sobre el rendimiento fotosintético.
O2 y tiempo (min) 1.0% 2.0% 4.0%
Distancia 15 30 45 60 15 30 45 60 15 30 45 60
10cm
20cm
6. CUESTIONARIO DE CONSULTA
A. Las reacciones fotosintéticas no lumínicas para la fijación del CO2 en plantas C3 se conoce como?
B. Los primeros productos estables después de la fijación de CO2 en plantas C3, C4 Y CAM son?
C. De al menos 3 razones por la cuales las plantas C4 son fotosintéticamente superiores a las C3.
D. En que consiste la fosforilación fotosintética?
E. La fotosíntesis es la principal de las reacciones biológicas en donde interviene la luz, pero su eficiencia en términos de la energía solar disponible es muy baja. ¿Cual es el significado de esta afirmación?.Explique
F. ¿Que eventos fundamentales ocurren en la fotofosforilación no cíclica y la cíclica
G. Cuales son las funciones del agua en la fotosíntesis?. Nombre por lo menos 2.
H. Enumere 8 factores internos y ambientales que regulan la fotosíntesis.
J- El origen de la energía específica para la reacción ADP + fosfato ATP por la enzima ATP sintetasa (factor de acoplamiento CF1) en las membranas tilacoides es:
K- Durante la fotofosforilación no cíclica, el agua es oxidada y sus electrones pasan a través del fotosistema II y después a través del fotosistema I, antes de reducir a:
L- Durante el transporte electrónico fotosintético, el compartimiento interior de las membranas tilacoides consigue:
M- La fuente general de la energía para la fotosíntesis es:
N- ¿Qué eventos ocurren durante las reacciones luminosas de la fotosíntesis?
P- Un balance global de la fotosíntesis en plantas es el uso de los electrones del agua para reducir ¿
Q- ¿Cuál de los siguientes enunciados no es cierto para el fotosistema II?
• Está localizado en las membranas tilacoides.
• Está implicado en la oxidación del agua.
• Tiene una clorofila oxidable especial, P680
• En el asociado un complejo antena para la actividad captadora de luz.
• Es requerido para la fotofosforilación cíclica
7. BIBLIOGRAFIA
ARISTIZABAL, M.L 2003. Fisiología Vegetal .Universidad de Caldas, Colombia. Manizales, Colombia.306p.
AZCON-BIETO, J.; TALON, M. 1993. Fisiología y Bioquímica Vegetal. Interamericana –Mc Graw Hill de España.581p
CURTIS, H.; SUE BARNES N. 1993. Biología. Quinta edición. Editorial Medica Panamericana S.A.Buenos aires-Argentina.1188p
AUDESIRK, T.; AUDESIRK, G. 1996. Biología, La vida en la tierra. Prentice-Hall Hispanoamericanaza. México.947p
KARP, G.2005. Biología Celular y Molecular. Conceptos y Experimentos. McGraw –Hill. P 92-129.
ENGER, E. AND ROSS, F.2004. Concepts in Biology. McGraw –Hill, eighth edition. P70-79.
MAUSETH, J.D. 2003. Botany, an introduction to plant Biology. Third Edition. University of Texas, Austin. Jones and Bartlett Publishers, Sudbury, Massachusetts. 848p
JIMENEZ, J.M. 1986. Manual de practicas de laboratorio de Biologia General. Escuela de Biolgia. Universidad de Costa Rica. 64p
Referencias electronicas
• http://www.unisanta.br/maramagenta/Imagens/ANATOMIA/cloroplasto.jpg&img.
• http://www.unizar.es/departamentos/bioquimica_biologia/docencia/Biofvirtual/Tema-FOTO/figure-19-
• http://www.unizar.es/departamentos/bioquimica_biologia.
PRACTICA ACCION DE UNA ENZIMA DE TEJIDOS VEGETALES Y ANIMALES
1. INTRODUCCIÓN
Las enzimas son proteínas importantes que dirigen casi todas las reacciones químicas que se llevan a cabo dentro de las células (Audesirk et al, 2003), agrega Hicks,( 2002), que estas proteínas disminuyen la cantidad de energía que se requiere para llevarla a cabo una reacción y cuya actividad catalítica es especifica. La primera evidencia de que las enzimas son proteínas la obtuvo James Summer en 1926, cuando cristalizo la enzima ureasa a partir de las semillas de Cannavalia ensiformis e identifico su composición. Decenios más tarde se acepto que todos los catalizadores biológicos eran proteínas. Sin embargo, recientemente se demostró que los catalizadores de ciertas reacciones biológicas son moléculas de RNA (Karp, 2005).
La acción de estos compuestos proteicos en una reacción se afecta por la variación de factores físicos y químicos tales como la temperatura, el ph y la concentración de la enzima y del sustrato (Hicks, 2002; Karp, 2005).
En esta práctica se realizaran experimentos con un catalizador inorgánico. (MnO2) y otro orgánico (peroxidasa). Esta ultima se encuentra tanto en tejidos vegetales como animales y actúa sobre el peroxido de hidrogeno o agua oxigenada (H2O2). Este peroxido es un producto de la actividad celular que al acumularse en exceso intoxica la célula, por lo cual debe ser degrado por una enzima especifica.
La reacción en la cual interviene las peroxidadas se representa de la siguiente manera:
Peroxidasa
2H2O2 2H2O + O2
Al observar esta reacción en el laboratorio se ven burbujas, que se reproducen debido al desprendimiento de oxigeno. La cantidad de burbujas es directamente proporcional a la intensidad de la reacción y puede utilizarse como medida aproximada de ella (U de A, 1995).
2. OBJETIVOS
• Observar el efecto de la enzima Peroxidasa, que se halla presente en tejidos animales y vegetales, sobre el agua oxigenada.
• Comparar la acción de la peroxidada (catalizador orgánico) y del bióxido de manganeso (catalizador inorgánico) sobre un mismo sustrato (agua oxigenada).
• Corroborar la acción de la temperatura sobre la acción de la enzima
• Comprobar el efecto de la variación de la temperatura en la actividad enzimático.
3. MARCO TEORICO
Una molécula de proteína que actúa como catalizador en la velocidad de reacción es denominada enzima (Enger and Ross, 2004). Son catalizadores biológicos, sintetizados por organismos vivos (Audesirk et al 2003, Tortora et al, 2007). Son muy eficientes y operan muy bien a bajas temperaturas, y están guiadas por varios controles en la célula (Tortora et al, 2007). La molécula con la que se une la enzima es llamada sustrato (Hicks, 2001, Elliot and Elliot, 2004; Kart, 2005). La acción de una enzima esta antecedido por la formación de un complejo enzima-sustrato. El primer paso en una reacción catalizada enzimaticamente es la unión del sustrato al centro activo de la enzima para formar el complejo E-S (Elliot and Elliot, 2004). Tortora et al,( 2007) manifiesta que las enzimas presentan usualmente formas globulares con formas tridimensionales.
Además de ser transportadores de oxigeno y electrones, las peroxidasas son hemoproteinas que catalizan reacciones, donde un átomo de oxigeno se ve transferido al sustrato y no mas al agua. La acumulación de estos compuestos (peróxidos) ocasiona un desequilibrio orgánico que se relaciona con la formación de radicales libres, esto conlleva a la destrucción de membranas (Carmona, _____).
4. MATERIALES
Tubos de ensayo de 17 x 150 mm, Gradillas, Parrillas de cera, Beakers de 1000ml, Pinzas de madera, Morteros, cucharas cafeteras, pipetas de 5 ml, Cuchillas, Hielo, bióxido de Manganeso (MnO2), Hígado fresco, papas, guantes de látex, peroxido de hidrogeno (agua oxigenada).
5. PROCEDIMEINTO
1. Acción de un catalizador inorgánico sobre el agua oxigenada
Marque tres tubos de ensayo con los números 1,2,3. Échele a cada uno una pequeña cantidad de bióxido de manganeso aproximadamente igual y proceda de la siguiente manera.
Nota: conserve en una gradilla todos los tubos que utilice en esta práctica para efectuar comparaciones).
a. Tome el tubo 1 por su parte inferior y agréguele 2 ml de agua oxigenada. Observe la intensidad de la reacción para que compare con los tubos siguientes. ¿Que papel desempeña el bióxido de manganeso en la reacción? ¿Hubo desprendimiento de calor?
b. Con unas pinzas ponga el tubo 2 al baño de Maria durante 10 minutos, Retírelo e inmediatamente agréguele 2ml de agua oxigenada. Observe la reacción y compárela con la anterior. ¿Ocurrió con mayor o menor intensidad ¿ ¿El aumento de la temperatura afecto el catalizador?
c. Ponga el tubo 3 en un recipiente con hielo durante 10 minutos. Retírelo e inmediatamente agréguele 2ml de agua oxigenada .Compare la reacción con las anteriores. ¿Como afecto la disminución de la temperatura la acción del bióxido de manganeso?
2. Acción de un catalizador de origen animal sobre el agua oxigenada
Marque 4 tubos de ensayo con los numros1, 2, 3,4 y proceda de la siguiente manera:
a. Tome el tubo 1 por la parte inferior, échele un pequeño pedazo de hígado y luego 2ml de agua oxigenada. Observe la intensidad de la reacción ?Que papel desempeña el hígado en la reacción ¿¿Cuál es la naturaleza química de las sustancias que catalizan esta reacción? ¿Hubo desprendimientote calor?
b. Tome de hígado similar ala anterior, échelo a en tubo 2 y póngalo al baño Maria durante 10 minuto. Retírelo inmediatamente agréguele 2ml de agua oxigenada ?Hubo reacción ¿Compare con el resultado obtenido en el ítem 1by explique lo observado
c. Tome el tubo 3, échele otro pedazo de hígado (que debe haberse puesto previamente 10minuto en un congelador o en un recipiente con hielo( en la misma cantidad anterior y agréguele inmediatamente 2ml de agua oxigenada.¿Hubo reacción ¿ ¿ Como es su intensidad en relación con la observada en el tubo 1 del ítem 2a ¿ ¿Qué efecto tiene la disminución de la temperatura sobre la acción del catalizador? ¿Cree usted que si el agua oxigenada se agrega después de dejar que el hígado vuelva a la temperatura ambiental, la intensidad de la reacción seria como la de dicho tuvo 1? Explique.
d. Tome el tubo 4 , échele media cucharada cafetera de macerado de hígado , es decir la misma cantidad con la que trabajo en los tres anteriores, y luego 2ml de agua oxigenada .¿Esta reacción es mayor o menor en intensidad a la del tubo 1 del ítem 2a ¿ ¿Por qué?
e. Tome los dos tubos que se pusieron al baño de Maria, tanto de este experimento como el del anterior en que se utilizo MnO2, y que ya deben estar a temperatura ambiente, y agrégueles nuevamente 2ml de agua oxigenada a cada uno? Que observa en cada tubo? explique resultados.
3. Acción de un catalizador de origen sobre el agua oxigenada
Marque cuatro tubos de ensayo con los números 1, 2, 3,4 y realice los mismos procedimientos a, b, c y d del numeral 2. Utilice, en todos ellos, papa en vez de hígado y para cada caso, responda las mismas preguntas que se hicieron en el citado numeral.
Después de hacer lo anterior, tome el tubo que puso al baño Maria y que ya debe de estar a temperatura ambiente, y agréguele nuevamente 2ml de agua oxigenada. Compare este resultado con el obtenido en le ítem 2e. ¿Que conclusiones puede sacar?
En términos genérela, ¿La intensidad de la reacciones fue mayor o menor cuando se utilizo hígado o cuando se utilizo papa? De al menos dos razones que expliquen su respuesta.
6. CUESTIONARIO DE CONSULTA
1. ¿En toda reacción enzimática hay liberación de energía? Explique
2. Siempre que en una reacción enzimático de libera energía, ¿es en forma de calor ¿ explique
3. ¿Que cambios pueden sufrir, con relación a la estructura química y al numero inicial de moléculas, el sustrato y la enzima en una reacción?
4. Si usted hace reaccionar agua oxigenada con peroxidasa y espera hasta que termine la reacción ¿Cómo comprobaría que la enzima conserva su poder catalítico?
5. ¿En cual organela celular se sintetiza las enzimas?
6. ¿Las enzimas naturales actúan únicamente en el interior de las células? explique por medio de varios ejemplos.
7. Que factores, además de los cambios en la temperatura y en el ph, influyen en la actividad de una enzima?
8. Desde el punto de vista enzimático. ¿Que diferencia hay entre la leche cruda y la leche pasteurizada?
9. ¿Como explicaría el hecho de que la ptialina de la saliva actué sobre el almidón en la boca pero no en e estomago
10. Cite cinco enzimas con los sustratos respectivos sobre los cuales actúan y los productos que se obtienen.
11. Explique brevemente como las enzimas aumentan la velocidad de reacción.
12- Señale al menos 10 características importantes de las enzimas.
13 -¿Que papel desempeñan las enzimas en la energía de activación de una reacción? Explique.
14- Mencione al menos 10 factores involucrados en la capacidad catalítica de la enzima.
15-La región de la enzima que encaja en el sustrato se denomina? Explique
16-Que factores importantes limitan la actividad enzimática? Mencione al menos 5.
17- El incremento de la velocidad de reacción se debe al aumento de la temperatura, haciendo que las moléculas del sustrato posean más energía para reaccionar, si la afirmación anterior es verdadera ¿Que ocurre cuando se disminuye la velocidad de reacción en la estructura terciaria de la molécula de enzima? ¿Que nombre recibe la molécula en este estado? Explique.
18-¿Las enzimas con perdida parcial de su estructura tridimensional, pueden recuperar sus cadenas polipéptidos y consecuentemente su actividad mediante que proceso? Explique.
19- ¿En que consiste la inhibición irreversible? De al menos 3 ejemplos y explique su funcionamiento.
7. BIBLIOGRAFIA
VÁSQUEZ-CONTRERAS E. 2003. Efecto de la temperatura en la actividad enzimática. Bioquímica y Biología Molecular en línea. Disponible en: http/bq.unam.mx/-evasquez.Consultado el 13 de Agosto de 2008
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ENGER, E. and ROSS, F.2004. Concepts in Biology. McGraw –Hill, eighth edition. P70-79.
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PRACTICA EXTRACCION DE ADN DE TEJIDOS VEGETALES
1. INTRODUCCIÓN
El ADN es la abreviatura del ácido desoxirribonucleico. El ADN es la molécula que contiene la información genética. Es el componente químico primario de los cromosomas y el material del que los genes están formados.
Esta compuesta de subunidades, llamadas nucleótidos, unidos en cadenas largas. Cada nucleótido consta de un grupo fosfato, un azúcar de cinco carbonos, la dexorribosa y una base nitrogenada. En el DNA se presentan cuatro bases diferentes: adenina, guanina, timina y citosina.
La transformación en bacterias y la infección de bacterias con bacteriófagos proporciono la primera evidencia de que el DNA es la molécula de la herencia.
El DNA de los cromosomas se componen de dos cadenas enrolladas una a la otra en una doble hélice .Los azucares y fosfatos que unen un nucleótido al siguiente forman el esqueleto en cada lado de la doble hélice .Solo pares especificos de bases, llamados pares de bases complementarios, se pueden unir en la hélice mediante enlaces de hidrogeno: adenina con timina y guanina con citosina. (Audesirk, and Audesirk; 1996.)
2. OBJETIVOS
• El objetivo fundamental de esta práctica es utilizar unas sencillas técnicas para poder extraer el ADN de un tejido vegetal y por el aspecto que presenta, confirmar su estructura fibrilar.
• A partir de la longitud enorme de las fibras también se confirma que en el núcleo el ADN se encuentra replegado.
3. MARCO TEORICO
El ADN fue identificado inicialmente en 1868 por Friedrich Miescher, biólogo suizo, en los núcleos de las células del pus obtenidas de los vendajes quirúrgicos desechados y en el esperma del salmón. Él llamó a la sustancia nucleína, aunque no fue reconocida hasta 1943 gracias al experimento realizado por Oswald Avery.
La estructura del ADN es una pareja de largas cadenas de nucleótidos. La estructura de doble hélice del ADN fue descubierta en 1953 por James Watson y Francis Crick. Una
Figura No 1. Estructura del ADN
larga hebra de ácido nucleico está enrollada alrededor de otra hebra formando un par entrelazado. Dicha hélice mide 3,4 nm de paso de rosca y 2,37 nm de diámetro, y está formada, en cada vuelta, por 10,4 pares de nucleótidos enfrentados entre sí por sus bases nitrogenadas (Carlson, 1998).
4. MATERIALES
Frutos de banano, fresas, papaya, cebolla de huevo, alcohol al 96% frió, agua destilada, NaCl, varilla de vidrio, morteros con pistilo, pipetas, probetas, papel filtro, Isopropanol, cuchillo, detergente liquido, indicador rojo fenol o azul de metileno.
5. PROCEDIMIENTO
• Prepare una solución de detergente/sal adicionando 3gr de sal y 3ml de detergente a 30 ml de agua destilada
• Prepare al 5% de ablanda carnes o solución de papaina al adicionar 5gr de ablanda carnes (enzima) a 95 ml de agua destilada. El jugo de piña o papaya puede ser sustituido por el ablanda carnes.
• El etanol al 96% debe estar helado.
• Prepare una solución de cloruro de sodio al 5% al adicionar 5gr de sal no yodada en 100 ml de agua destilada,
• Prepare el rojo fenol al disolver lo que venga en un palillo en 100 ml de agua destilada. La solución restante es de color ámbar claro. Cuando el fenol es adicionado a una solución ácida esta se torna rosada / roja.
• Coloque un pedazo de cebolla, banano o fresa según el caso en el mortero y adicione 10 ml de la solución de sal /detergente y macere por unos minutos.
• Decantar el filtrado de la mezcla en un tubo de ensayo limpio. Adicione 3 o 4 ml de la solución ablanda carnes/enzima .Mezclar.
• Retire 1 o 2 ml del filtrado y agregarle 10 ml de etanol o isopropanol.
• Coloque 10ml de etanol o isopropanol frió para formar una capa arriba de la mezcla del tejido vegetal. Esperar 3 minutos.
• Haga un movimiento circular con la varilla de vidrio, lentamente muevala hacia a través de la interfase de las dos capas para recolectar el ADN con aspecto de moco y colóquelo en un tubo de ensayo limpio con 4% de solución salina.
• Adicione 5 gotas de indicador de rojo fenol a la solución de DNA. (Averill, 1993).
Figura 2. Formación de las fibras de DNA.
Esta práctica puede completarse con una tinción específica de ADN.
Tenemos que tomar una muestra de las fibras que se van depositando sobre la varilla de vidrio y depositarlas sobre un portaobjetos.
Teñir durante unos minutos con un colorante básico.
Observar al microscopio.
6. CUESTIONARIO DE CONSULTA
A. La extracción de ADN requiere una serie de que etapas básicas?.
B. Cual es el papel del jabón liquido y la sal en la extracción de ADN?
C. Cual es la función del alcohol en la extracción de ADN?
7. BIBLIOGRAFIA
CARLSON, S. (1998). Deshilando el tejido de la vida. Investigación y Ciencia. 266, 84-85.
(AUDESIRK, T.; AUDESIRK, G. 1996.) Biología, La vida en la tierra. Prentice-Hall Hispanoamericana-. México.947p
AVERILL, ELLEN. 1993. Extracción de DNA de cebolla. Woodrow Wilson Biology Institute. Disponible en: www.roodrow.org/teachers/bi/1993/isolation2.html
PRACTICA DE MITOSIS II
1. INTRODUCCIÓN
La continuidad de la vida depende de la reproducción. En el proceso, los padres producen una nueva generación de células o individuos multicelulares iguales a ellos. La división celular constituye un puente entre las generaciones (Starr and Taggart ,2004). Agregan los mismos autores, que si una célula se divide, cada uno de sus dos células hijas recibe el número necesario de moléculas de ADN y parte de citoplasma. En células eucariontes, el mecanismo de división llamado mitosis clasifica el ADN en los dos nuevos núcleos. Un mecanismo adicional divide el citoplasma.
En tal sentido expresa Mauseth (2003), como el ciclo celular involucra dos procesos a saber: el primero la división del núcleo llamado cariocinesis y la segunda la división del citoplasma denominada citocinesis. Adiciona el anterior autor, que existen dos tipos de cariocinesis: mitosis y meiosis.
Cuando la célula está en los estadios interfásicos del ciclo, los cromosomas son visibles dentro del núcleo sólo como delgadas hebras de material filamentoso llamado cromatina. (Curtis et al., 2003)
2. OBJETIVOS
• Determinar el índice mitótico de las células de raíz de cebolla.
• Reconocer y comprender las diferentes fases de la mitosis.
• Estudiar la mitosis en células somáticas de cebolla.
• Visualizar la Mitosis como mecanismo de crecimiento y reproducción asexual.
• Investigar sobre la importancia biológica de la mitosis.
3. MARCO TEORICO
Como ya se menciono, la mitosis es una división donde es la duplicación de los cromosomas o cariocinesis. Siendo este, una forma de crecimiento e incremento de células en eucariontes multicelulares (Mauseth, 2003; González et al, 2004, Starr and Taggart, 2004).
La mitosis tiene como objetivo conservar el mismo número de cromosomas característico de cada especie. Obteniéndose como resultado de la mitosis dos células diploides, cada una idéntica a la célula original y con cromosomas idénticos en estructura y función. (Roldan et al ,1984).
Algunas del as fases que trataremos de identificar son:
La interfase, donde las células están reposo, los cromosomas no son visibles y núcleos con apariencia granular.
La profase, los cromosomas son claramente visibles, y la membrana nuclear desaparece.
La metafase, los cromosomas se ubican en el ecuador celular aparece una estructura fibrilar llamada el huso, una zona particular de cada cromosoma llamada centrómero.
El anafase, las dos cromatidas unidas de cada cromosoma se separan, y se mueven hacia los polos de cada célula; así se pueden observar dos grupos idénticos de cromatidas en la célula.
La telofase, los cromosomas pierden su apariencia distintiva. En la placa ecuatorial de la célula empieza a aparecer la nueva pared celular que divide las dos células hijas; los núcleos de éstos empiezan a diferenciarse. Reaparece la membrana nuclear.
Las células hijas, simulan ser células en interfase con núcleo bien diferenciado y los cromosomas no visibles, excepto que son la mitad de tamaño normal y antes de la próxima división cada núcleo tiene que alcanzar el tamaño de la célula original (Jiménez, 1986). Ver figuras No 1 y 2.
Figura No 1. Fases de la mitosis. 100x (Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín .Escuela de Biociencias.2008)
Figura No 2. Fases de la mitosis. 100x (Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín .Escuela de Biociencias.2008)
4. MATERIALES
Microscopio, Pinzas de madera, meristemo apical de cebolla, Tubos de ensayo 10 ml.
Alcohol etílico, Papel de filtro, ácido acético, Mecheros, Acetocarmin, Pinzas, Cuchillas de afeitar nuevas, portaobjetos y cubreobjetos.
5. PROCEDIMIENTO
• Realice un montaje de una cebolla de huevo como aparece en la figura No. Con mínimo ocho (8) días de antelación.
Figura No. 3. Montaje de cebolla (Allium sp) para inducir el crecimiento de raíces.(Laboratorio de Biología, Escuela de Biociencias,Sede Medellín)
• Tres de los ocho días, deje el montaje de la cebolla en completa oscuridad y después retire de este estado.
• Una vez en el laboratorio, corte 3 o 4 mm del extremo inferior de algunas raicillas(a mayor cantidad de ellas mayor chance de observar fases)
• Si es necesario, descarte 1 mm de la raíz, que correspondiente a la cofia.
• Los 2 o 3 mm restantes sumérjalos en un tubo de ensayo con carnoy (ácido acético y alcohol) en proporción 1:2 por varios minutos.
• Flamear las raíces junto a la solución por 2 minutos aproximadamente, evitando la ebullición violenta.
• Al cabo de este, retire los trozos de raíces y colóquelos en una lamina portaobjetos, agregándoles una o dos gotas de acetocarmin(colorante de origen vegetal)
• Macere firmemente, con la ayuda de una espátula por varios minutos
6. CUESTIONARIO DE CONSULTA
A-Cual es el papel biológico de la mitosis?
B-Porque se utiliza meristemo apical de raíz y no otro órgano de la planta?
C-Que papel cumple el carnoy en el protocolo realizado?
D- Que papel cumple el acetocarmin en el protocolo realizado?
E-En que fase de la mitosis hay síntesis y duplicación del ADN?
F-Las características presentes en las fases de la mitosis de células vegetales es igual a la células animales?
7. BIBLIOGRAFIA
STARR, C.; TAGGART, R.2004. Biología, La unidad y la división de la vida. Editorial Thomson. Décima edición.P150-161.
GONZALEZ, T., SPINEL, C.2004. Practica de laboratorio Biología Celular. Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Ciencias. Sede Bogota .87p.
MAUSETH, J.D. 2003. Botany, an introduction to plant Biology. Third Edition. University of Texas, Austin. Jones and Bartlett Publishers, Sudbury, Massachusetts. 848p.
CURTIS, H.; SUE BARNES, N. 1994. Biología. Editorial medica Panamericana. 1199p
JIMENEZ, J.M. 1986. Manual de Practicas de Laboratorio de Biología General. Universidad de Costa Rica. Escuela de Biología.64p.
PRACTICA EXTRACCION, SEPARACION DE PIGMENTOS FOTOSINTETICOS
1-INTRODUCCIÓN
El color no es únicamente un carácter llamativo de la vegetación, sino que, además, algunos de los pigmentos que lo condicionan están estrechamente ligados a las actividades fisiológicas del propio vegetal. Por consiguiente, el estudio de cómo las plantas viven y se desarrollan requieren el previo conocimiento de los pigmentos vegetales (González, 2008).
Un pigmento es cualquier sustancia que absorba luz. Algunos pigmentos absorben luz de todas las longitudes de onda y, por tanto, parecen negros. Otros solamente absorben ciertas longitudes de onda, transmitiendo o reflejando las longitudes de onda que no absorben .La clorofila absorbe luz en las longitudes de onda violeta, azul y rojo. El patrón de absorción de un pigmento se conoce como espectro de absorción de esa sustancia (Curtis and Sue, 1994).
2. OBJETIVOS
• Extraer y separar los pigmentos fotosintéticos mediante una técnica sencilla de cromatografía en papel.
• Mostrar mediante cromatografía ascendente, mono o bidimensional la separación de los pigmentos de las plantas.
• Comparar los pigmentos obtenidos de diferentes plantas.
• Observar el desplazamiento de los distintos pigmentos.
• Calcular el coeficiente o frente de migración (Rf) de cada uno de los pigmentos encontrados.
• Comprender la importancia de los pigmentos accesorios.
3. MARCO TEORICO
Los cloroplastos contienen varios tipos de moléculas que absorben diferentes longitudes de onda de luz (Audesirk and Audesirk, 1996), estos pigmentos pertenecen a tres tipos de estructura:
La clorofila, las Ficobilinas (ficoeritrina y ficocianinas) y los carotenoides (carotenos y Xantofilas), Niemeyer, (1978). La clorofila, la molécula principal que capta energía en las membranas tilacoides (Curtis and Sue, 1994; Audesirk and Audesirk, 1996), absorbe intensamente la luz violeta, azul y roja pero refleja el verde y, por tanto, las hojas se ven verdes. Los tilacoides poseen otras moléculas, llamadas pigmentos accesorios, que captan energía luminosa y la transforman en clorofila. Los carotenos absorben la luz azul verde y reflejan el amarillo, anaranjado o rojo; las ficocianinas absorben el verde y el amarillo y se ven de color azul o púrpura (Audesirk and Audesirk, 1996) y las ficoeritrinas del grupo de las Ficobilinas al cual pertenecen (Niemeyer, 1978).
PIGMENTO COLOR
Clorofila A Verde azulado
Clorofila B Verde amarillento
Carotenos Naranja
Xantofilas Amarillo
Entre los distintos métodos que existen para separar, o fraccionar los componentes de una mezcla vegetal (hojas) se encuentra la cromatografía. Esta técnica según Domínguez (1975) deriva del griego, (chroma=color, graphos=escritura) y es un procedimiento físico químico que permite separar los componentes o sustancias integrantes de una mezcla en movimiento (disolventes o portadores) por adsorcion o separación diferencial de estos componentes sobre una superficie estacionaria o inmóvil (adsorbente o papel). En la separación cromatográfica, el disolvente, el adsorbente y los componentes de la mezcla que se están separando o resolviendo, interaccionan entre sí y por ello constituyen un sistema cromatografico Para Abbott and Andrews (1970) la cromatografía de papel es una de las técnicas mas simples y de las mas antiguas. En ella, la separación se realiza sobre tiras de papel de filtro cromatografico.
Todas estas sustancias presentan un grado de solubilidad diferente permitiendo separarlas. Cuando se utiliza un disolvente, este asciende por capilaridad el papel filtro de cromatografía; arrastrando consigo los pigmentos mas solubles; estos ascienden con mayor velocidad de los pigmentos que no lo son. Si se deja actuar el disolvente durante un tiempo determinado, se seca el papel y se observan inmediatamente las sustancias separadas, si tiene color, o reveladas como manchas por medio de una reacción química apropiada. Esta técnica se conoce como cromatografía monodimensional y el papel resultante recibe el nombre de cromatograma monodimensional (Smith and Feinberg, 1979) ver figura No2. Los disolventes se eligen con vistas a conseguir los mayores efectos diferenciales en la solubilidad de las sustancias a separar: como ningún disolvente puede producir las diferencias máximas de solubilidad para todas las sustancias implicadas; se acude con frecuencia al recurso de utilizar dos disolventes con diferentes propiedades; que actúan sucesivamente en direcciones que forman un ángulo recto. (Ver figura No. 1). Esto se conoce como cromatografía bidimensional, y el papel resultante se llama cromatograma bidimensional.
Finalmente se forman franjas muy definidas, con distintos colores, permitiendo estimar el Rf (coeficiente o frente de reparto) o migración) de cada pigmento. El Rf se define como la razón o cociente de las distancias recorridas simultáneamente desde el origen hasta el centro de la mancha de una sustancia y el frente de la fase móvil (disolvente). Consiste en colocar una gota de la muestra a unos 2 o 3 cm. del borde de una hoja o tira de papel de filtro, se marca el sitio (origen) con un lápiz de grafito. El extremo del papel más próximo al sitio o punto donde se coloco la gota se sumerge en un disolvente apropiado contenido en un frasco, cubeta o recipiente adecuado (Domínguez, 1975).
Xp
Rf= ___
Xd
Figura No 1. Cálculo del coeficiente migración o frente de reparto (Rf).Donde Xp es la distancia recorrida por el pigmento y Xd la distancia recorrida por el solvente.
Los pigmentos clorofílicos son insolubles en el solvente universal llamado agua, pero sí son solubles (afinidad química) en solventes orgánicos como por ejemplo alcohol etílico y acetona. A los solventes que extraen simultáneamente todos los pigmentos de la hoja se los suele llamar extractantes. Existen otros solventes que presentan afinidad por algunos pigmentos y se los llama separadores, como por ejemplo el tetracloruro de carbono (cancerigeno) y el éter de petróleo (muy volátil). El método por cromatografía se utilizará como extractante la acetona, alcohol, agua (extracción de pigmentos hidrosolubles) y como separador el éter de petróleo (González ,2002)
Entre los pigmentos liposolubles se tienen: los carotenos, xantofilas, clorofila a y b. En el grupo de pigmentos hidrosoluble s se encuentran: Los flavonoides (amarillos), la ficoeritrina (rojos), ficocianina (azules), antocianina (violeta o púrpura).
Figura No2.Cromatografía ascendente de papel .Mostrando los pigmentos liposolubles. W.Gurrero C
Figura No 3.Cromatografía monodimensional. Mostrando los pigmentos liposolubles extraídos de gramínea.
4. MATERIALES
Morteros con pistilo, hojas de Laurel (Ficus benjamina), Espinaca, Hierbabuena, Perejil, pasto, Croto (Codeaeium variegatum), Papel de cromatografía (W1, W2, W3 (Rugosa), W3MM, W4, W50 (muy suave)), Embudo de vidrio y embudo de papel filtro, alcohol etílico (96%), Tubos de ensayo grande, probeta de 50 ml, Éter de Petróleo
Arena de cuarzo, gradillas, Cajas petri, Acetona.
5. PROCEDIMIENTO
(Metodología tomada y adaptada de Cromatografía sobre papel y capa fina. Electroforesis (Smith and Feinberg, 1979)
Primera Actividad. Extracción de pigmentos con alcohol
1º. Coloca en el mortero las hojas que hayas elegido, añade 50 cc de alcohol y tritúralas hasta que el alcohol adquiera un tinte verde intenso.
2º. Filtrar el líquido utilizando el embudo en el que habrás puesto el filtro de papel, recogiendo el filtrado en un elermeyer.
3º. Verter el filtrado sobre cajas de petri
4º. Recorta cuadrados de papel de papel filtro y dóblelas en V, introdúcelas en la caja petri hasta que toquen su fondo, procura que se mantengan verticales ayudándote con la pinza.
5o.Espera 30 minutos y aparecerán en la parte superior de la tira de papel unas bandas de colores que señalan a los distintos pigmentos.
6-Determina el frente de migración para cada uno de los pigmentos encontrados.
Segunda Actividad. Extracción de pigmentos con acetona
1º. Coloca en el mortero las hojas que hayas elegido, añada un poco acetona y tritúralas hasta que adquiera un tinte verde intenso.
2º. Filtrar el líquido a media caja petri, utilizando el embudo en el que habrás puesto el filtro de papel.
3º. Verter el filtrado sobre cajas de petri.
4º. Recorta cuadrados papel filtro y dóblalas en V y sumérgelos en la caja petri, el líquido sube por capilaridad, deje subir solo un centímetro. Dejar secar el papel.
5o .Deja en reposo por 30 minutos aproximadamente y aparecerán en la parte superior de la tira de papel unas bandas de colores que señalan a los distintos pigmentos.
6-Determina el frente de migración para cada uno de los pigmentos encontrados.
Tercera Actividad. Extracción de pigmentos con agua
1º. Coloca en el beaker con agua las hojas de croto (Codeaeium variegatum), hasta que hiervan.
2º. Filtrar el líquido a media caja petri, utilizando el embudo en el que habrás puesto el filtro de papel.
3º. Verter el filtrado sobre cajas de petri.
4º. Recorta cuadrados papel filtro y dóblalas en V y sumérgelos en la caja petri, el líquido sube por capilaridad, deje subir solo un centímetro. Dejar secar el papel.
5o .Deja en reposo por 30 minutos aproximadamente y aparecerán en la parte superior de la tira de papel unas bandas de colores que señalan a los distintos pigmentos.
6-Determina el frente de migración para cada uno de los pigmentos encontrados.
6. CUESTIONARIO DE CONSULTA
A. Calcule el Rf de los pigmentos encontrados en el cromatograma.
B. Cuales factores influyen en los valores del Rf de un pigmento? Mencione y explique 10 de ellos.
C. Anote las características del Rf y color de cada pigmento separado con cada solvente. Identifique los pigmentos con esos antecedentes.
D. Cual es la estructura de la clorofila a? En que difiere la estructura de la clorofila b?
E. Que factores intervienen en la síntesis de la clorofila.
F. Anote la formula estructural de cada uno de los pigmentos encontrados en el cromatograma
G. La clorofila a difiere de la clorofila b respecto a su estructura química en?
H. La gran eficiencia de las clorofilas radica en que aspectos
I. Desde el punto de vista químico los carotenos son?
J- Se sabe que la clorofila “a “disuelta en acetona exhibe un máximo de absorción de 663nm, sin embargo en células enteras presenta varios máximos de absorción 660, 670, 680, 685,690, y 700-720. ¿Qué significado tiene este hecho?
¿Señale por lo menos tres razones que expliquen lo anterior?
k- Se sabe que Las clorofilas son pigmentos primarios.¿Cual es el significado de esto?
L-Es bien sabido que la cantidad de clorofila a duplica la clorofila b,¿Qué factores están asociados a ello?
LL-Que tipo de pigmentos carotenoides están presentes en los tilacoides?
M-Un principio importante en la absorción de luz por parte de cualquier molécula es que ésta solo puede absorber un fotón a la vez.¿Que significado tiene esto en la absorción de luz por parte de la clorofila?
N-Defina y compare espectro de absorción y espectro de acción.
7. BIBLIOGRAFIA
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PRACTICA MEDICION DE pH
1. INTRODUCCIÓN
El ph de una solución es la medición de su concentración de iones de hidrógeno (Audesirk and Audesirk, 1996).
Manifiesta Spencer et al,(2000)que Por definición, el logaritmo de un numero es la potencia a la que se debe elevar una base para obtener ese numero, por tanto; el logaritmo base 10 de 10-7 es -7. Log (10-7)= -7, como las concentraciones de los iones H3O+ Y OH- en soluciones acuosas suelen ser menores que 1M, sus logaritmos son números negativos. Al considerar que los números positivos son más cómodos, se sugirió cambiar el signo del logaritmo después de haberlo calculado. Así se introdujo el símbolo “p” para indicar el negativo del logaritmo de un número. Por lo tanto, pH es el negativo del logaritmo de la concentración de iones H3O+:
pH≈ -log (H3O+)
El concepto de pH comprime el intervalo de concentraciones de H3O+ a una escala cuyo manejo es mucho más fácil. A medida que disminuye la concentración de H3O+ desde una molaridad aproximada de 1 hasta 10-14, que es lo que se suele encontrar en el laboratorio, el pH aumenta de 0 a 14. Spencer et al,(2000) y Petrucci and Harwood(1997).
También podríamos decir a partir de la definición de logaritmo que:
y = Log x; x=10y (Reboiras, 2006)
2. OBJETIVOS
• Identificar el potencial de hidrógeno de soluciones conocidas.
• Calcular el ph de forma aproximada de varias bebidas dada su concentración de hidrogeniones.
3. MARCO TEORICO
La determinación del pH en el agua es una medida de la tendencia de su acidez o de su alcalinidad. No mide el valor de la acidez o alcalinidad. Un pH menor de 7.0 indica una tendencia hacia la acidez, mientras que un valor mayor de 7.0 muestra una tendencia hacia lo alcalino. La mayoría de las aguas naturales tienen un pH entre 4 y 9, aunque muchas de ellas tienen un pH ligeramente básico debido a la presencia de carbonatos y bicarbonatos. Un pH muy ácido o muy alcalino, puede ser indicio de una contaminación industrial. El valor del pH en el agua, es utilizado también cuando nos interesa conocer su tendencia corrosiva o incrustante, y en las plantas de tratamiento de agua.
Este método determina el pH, midiendo el potencial generado (en milivoltios) por un electrodo de vidrio que es sensible a la actividad del ión H+, este potencial es comparado contra un electrodo de referencia, que genera un potencial constante e independiente del pH. El electrodo de referencia que se utiliza es el de calomel saturado con cloruro de potasio, el cual sirve como puente salino que permite el paso de los milivolts generados hacia al circuito de medición. La cadena electroquímica de este sistema de medición es:
Hg / Hg2Cl2-Sol Sat KCl // Vidrio/HCl 0.1N/Ag-AgCl
En el siguiente esquema se muestran los electrodos utilizados:
Figura No 1 .Tipos de electrodos en phmetro
El electrodo de vidrio es relativamente inmune a las interferencias del color, turbidez, material coloidal, cloro libre, oxidante y reductor. La medición se afecta cuando la superficie de la membrana de vidrio esta sucia con grasa o material orgánico insoluble en agua, que le impide hacer contacto con la muestra, por lo anterior se recomienda la limpieza escrupulosa de los electrodos. En muestras de un pH mayor a 10, se presenta el error del sodio, el cual puede ser reducido utilizando electrodos especiales de bajo error de sodio y haciendo las correcciones indicadas en el instructivo del electrodo. La temperatura tiene dos efectos de interferencia, el potencial de los electrodos y la ionización de la muestra varían. El primer efecto puede compensarse haciendo un ajuste en el botón de la " temperatura" que tienen todos los aparatos. El segundo efecto es inherente de la muestra y solo se toma en consideración, anotando la temperatura de la muestra y su pH; para más exactitud, se recomienda que la muestra esté a 25 ° C, que es la temperatura de referencia para la medición del pH.
4. MATERIALES
Potenciómetro, solución amortiguadora de KCL, bebidas para la medición (Aguardiente, cerveza, Jugo de limón, Hidróxido de sodio, gaseosa, café, yogurt).
5. PROCEDIMEINTO
Una vez calibrado el aparato de medición de pH, se procede a la medición de la muestra:
1. Mida la temperatura de la muestra y ajuste el medidor con el botón de Temperatura
2. Inserte los electrodos en la muestra y lea el pH correspondiente.
3. Elevar y enjuagar los electrodo con agua destilada
4. Almacenar los electrodos en solución amortiguadora de pH 7 o menor.
6. CUESTIONARIO DE CONSULTA
A. ¿Que requisitos son indispensables para determinar un pH en forma correcta?
B. ¿Que pH tendrá una muestra cuya concentración de iones H+ es de 0.00001 M?
C. ¿Que características de acidez o alcalinidad tiene una muestra que dio un pH de 6.37?
D. Calcule de forma aproximada el pH de una bebida cuya concentración de iones H3O+ es de 0.00145 M.
7. BIBLIOGRAFIA
AUDESIRK, TERESA; AUDESIRK, GERALD.1996.Biología. La vida en la tierra.Prentice Hall.947p
PETRUCCI, R.; HARWOOD, W.S.1997. General Chemistry, Principles and Modern Applications. Prentice Hall. Seventh Edition.p581-594.
SPENCER, J.N; BODNER, G.M; RICKARD, L.H. 2000.Química: Estructura y dinámica. Primera edición. Compañía Editorial Continental. P494-498
REBOIRAS, M.D.2006.Química: La ciencia básica. Thomson editorial. P690-694
